叢倩倩 崔 曉 王慶武

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000）

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種珍貴的藥用真菌，含有多糖、三萜等多種有效活性成分，具有抗腫瘤、護(hù)肝、提高免疫力、美容養(yǎng)生、延年益壽等多種功效，是一種理想的保健食品[1-2]。

近年來，我國靈芝栽培、深加工業(yè)得到迅速發(fā)展，市場(chǎng)規(guī)模逐步擴(kuò)大，靈芝產(chǎn)業(yè)已成為我國最重要的食藥用菌產(chǎn)業(yè)，因此靈芝優(yōu)良品種的選育尤為重要。雜交育種是食用菌新品種選育中使用最廣、收效最顯著的手段，其基本育種材料是單核體。單核體常規(guī)的是從擔(dān)孢子中分離單個(gè)孢子獲得，但是靈芝孢子人工條件下很難萌發(fā)，無法通過常規(guī)的單孢分離技術(shù)進(jìn)行雜交育種。1989年，Peberdy在研究絲狀真菌原生質(zhì)體制備和再生時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌絲體的原生質(zhì)體中含有三種類型，即無核、單核、雙核原生質(zhì)體[3]。隨后，潘迎捷等發(fā)現(xiàn)單核原生質(zhì)體是異宗結(jié)合食用菌原生質(zhì)體中的一個(gè)普遍現(xiàn)象[4]，利用這一現(xiàn)象可以從菌絲體中直接得到單核體，而不受出菇和孢子的限制[5]。因此可以通過原生質(zhì)體單核化來獲得靈芝雜交育種材料。

研究以3個(gè)靈芝菌株為供試材料，分別制備其原生質(zhì)體，并從中篩選單核菌株，比較單核與雙核、不同交配型單核菌株之間的生長特性，以期為今后靈芝單核雜交育種提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

靈芝菌株為泰山赤靈芝1號(hào)、靈芝4895、野生靈芝2，均由泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌所保存。

液體（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g。加水1 L，pH自然。液體再生培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，甘露醇0.6 mol/L。加水1 L，pH自然。

穩(wěn)滲劑：0.6 mol/L甘露醇。溶壁酶：購自廣東微生物研究所，用0.6 mol/L甘露醇配成2%濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備與再生

分別取供試菌株的原種菌塊接入含有100 mL液體PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d。菌液9600×g離心15 min，去上清，

菌絲用無菌水洗滌一次，濾紙吸干菌絲水分。稱取0.5 g菌絲于5 mL離心管中，加入2 mL 2%的溶壁酶，30℃水浴2.5 h，濾去殘留菌絲，0.6 mol/L甘露醇清洗2次，離心收集原生質(zhì)體，用液體再生培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后涂布于固體再生培養(yǎng)基平板上，25℃靜置培養(yǎng)72 h至長出再生菌落。

1.2.2 單核菌株的篩選

從供試菌株原生質(zhì)體再生平板上挑取菌落小，生長比較緩慢的單菌落分別轉(zhuǎn)接到PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待菌絲長出后挑取少量菌絲鏡檢，無鎖狀聯(lián)合的為單核再生菌株。

1.2.3 單核菌株交配型的確定

圖1 單核菌株與其出發(fā)菌株的宏觀菌落形態(tài)

每種供試菌株得到的原生質(zhì)體單核菌株應(yīng)具有兩種不同的交配型。分別隨機(jī)選取一株已經(jīng)鑒定的單核菌株作為標(biāo)準(zhǔn)，然后將每種供試菌株的其他單核菌株分別與這一標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行配對(duì)，配對(duì)時(shí)，兩菌株各取5 mm菌塊接種于PDA平板上，相距約2 cm，大約7 d后在菌絲交接處挑取菌絲鏡檢，有鎖狀聯(lián)合的證明兩菌株為不同的交配型；無鎖狀聯(lián)合的證明兩菌株為相同的交配型。

1.2.4 單核菌株生長情況的測(cè)定

采用平板培養(yǎng)菌絲體，25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，“十字交叉”法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲長速并觀察記錄菌絲長勢(shì)。

1.2.5 單核菌株微觀形態(tài)觀察

用載玻片刮取培養(yǎng)皿邊緣菌絲制成玻片標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下先用10倍物鏡找到目標(biāo)，然后用40倍物鏡對(duì)不同交配型單核菌絲進(jìn)行形態(tài)觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)靈芝菌株單核菌株的得率

三個(gè)靈芝菌株原生質(zhì)體單核化菌株得率見表1。由表1可以看出，TL-1單核得率最高為52.5%，其次4895為38.3%，YSL-2單核得率最低為5%。說明不同靈芝菌株單核菌株的得率是不同的，TL-1獲得單核菌株的概率較高，YSL-2則較低。

表1 三個(gè)靈芝菌株單核菌株的得率及兩種交配型比例

2.2 三個(gè)靈芝菌株原生質(zhì)體單核菌株交配型測(cè)定

三個(gè)靈芝菌株原生質(zhì)體單核菌株交配型測(cè)定結(jié)果見表1。TL-1獲得了兩種交配型的單核菌株，分別命名為TL-1-DH1和TL-1-DH2，兩種交配型數(shù)量之比為16∶5，而4895、YSL-2均只獲得了一種交配型，分別命名為4895-DH、YSL-2-DH，說明不同靈芝菌株兩種交配型單核菌株的獲得比例不同，TL-1比其他兩個(gè)菌株較易獲得兩種交配型單核體。4895和YSL-2的其中一種交配型單核菌株相對(duì)較易獲得，而另一種交配型單核菌株不易得到。此外還可以看出，三個(gè)菌株兩種交配型單核體的分離比例均不符合1∶1的理論值。

2.3 單核菌株與其出發(fā)菌株以及不同單核菌株之間的形態(tài)特征比較

單核菌株與其出發(fā)菌株以及不同單核菌株之間的宏觀、微觀形態(tài)特征見圖1、圖2和表2。

由圖1可以看出，不同單核菌株之間以及不同單核菌株與出發(fā)菌株之間菌絲長速以及菌落形態(tài)均表現(xiàn)出明顯的差異。4種單核菌株在菌絲生長速度上與其出發(fā)菌株比，均表現(xiàn)出生長速度變慢的現(xiàn)象，且同一菌株具有兩種不同交配型的單核菌株生長速度以及菌落形態(tài)也存在差異。TL-1-DH1和TL-1-DH2單核菌株其出發(fā)菌株均為TL-1，但TL-1-DH1菌絲濃密厚薄均一，邊緣不整齊，長速為0.87 cm/d；TL-1-DH2的菌落中間較濃密，邊緣較稀薄整齊，厚薄不一，長速為0.95 cm/d，快于TL-1-DH1，也快于4895-DH和YSL-2-DH；4895-DH氣生菌絲較多，菌落中間較濃密，邊緣不整齊，長速最慢為0.69 cm/d；YSL-2-DH菌絲濃密，邊緣整齊且厚薄均一。

圖2 四種不同交配型單核菌株菌絲的微觀形態(tài)（400×）

表2 三個(gè)靈芝菌株不同交配型單核菌株菌落形態(tài)特征比較

不同交配型的單核菌絲體的微觀形態(tài)見圖2。由圖2可以看出在光學(xué)顯微鏡下觀察不同交配型單核菌絲體的形態(tài)也表現(xiàn)出明顯的差異。YSL-2-DH菌絲比較密集；TL-1-DH1和TL-1-DH2菌絲生長比較規(guī)則，分支少；4895-DH菌絲生長凌亂、分支較多。

3 小結(jié)與討論

一般來說，單核菌絲的生長速度比雙核菌絲慢，在再生培養(yǎng)基中要盡量挑取菌落較小、生長比較緩慢的單菌落。在三個(gè)靈芝菌株原生質(zhì)體再生平板上，分別挑取菌落較小、生長較慢的單菌落，均獲得了單核體菌株，但是4895、YSL-2均只獲得了一種交配型單核體，如果進(jìn)一步加大原生質(zhì)體的再生數(shù)和挑取菌落數(shù)可能會(huì)篩選到另一種交配型的單核體。

試驗(yàn)獲得了TL-1兩種交配型單核體，分離比例為16∶5，4895、YSL-2均只獲得了一種交配型單核體，三個(gè)靈芝菌株兩種交配型單核體的分離比例均不符合1∶1的理論值，這與吳小平、朱朝輝等的報(bào)道類似[6-7]，分析原因可能是因?yàn)閮煞N交配型單核體的再生速度和再生能力不同，一種交配型單核體的再生速度較快、再生能力較強(qiáng)，在再生前期出現(xiàn)的菌落中出現(xiàn)，因此較易獲得；而另一種單核體再生速度較慢、再生力較弱，在再生后期出現(xiàn)的菌落中由于雙核菌絲的迅速生長，覆蓋了再生的單核體，因此不容易挑取到。

研究中四種單核菌株的生長情況、宏觀、微觀菌落形態(tài)均表現(xiàn)出一定程度的差異，這為以后雜交育種親本的選擇提供了理論指導(dǎo)，但是單核菌株生長情況的好壞與其雜交后代農(nóng)藝性狀的好壞并不是成正相關(guān)的，單核菌株生長狀況弱的，其雜交后代的農(nóng)藝性狀并不一定差，單核菌株生長較好的，其雜交后代的農(nóng)藝性狀也不一定優(yōu)良，所以在以后的研究中要把這些單核菌株都作為雜交育種的材料，兩兩均配對(duì)雜交以增加獲得優(yōu)良菌株的機(jī)會(huì)。