韓增華 楊洪博 戴肖東 馬銀鵬 陳賀 張丕奇*

（1黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150090；3東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是十分珍貴的藥用真菌，由于其藥效顯著，近年來(lái)遭到過(guò)度采摘，面臨枯竭[1]。因其子實(shí)體與菌絲體內(nèi)含有的成分和功效基本相當(dāng)[2]，人們開(kāi)始研究快速獲得菌絲體及其產(chǎn)物，來(lái)替代瀕臨枯竭的野生樺褐孔菌。深層發(fā)酵技術(shù)因其發(fā)酵周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)物收率高及占地面積小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸獲得認(rèn)可[3-5]。20世紀(jì)末韓國(guó)開(kāi)始使用深層發(fā)酵法生產(chǎn)樺褐孔菌多糖[6]，2004年我國(guó)開(kāi)始相關(guān)研究[7-8]。樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)菌絲及多糖量的變化受到諸如營(yíng)養(yǎng)元素（氮源、碳源）和發(fā)酵條件等影響[9-12]，發(fā)酵培養(yǎng)獲得活性物質(zhì)其活性高于或相當(dāng)于從子實(shí)體中提取的物質(zhì)活性[13-15]。試驗(yàn)選用了5株樺褐孔菌菌株，通過(guò)單一碳、氮源比較，復(fù)合碳、氮源正交試驗(yàn)，最終利用較廉價(jià)發(fā)酵原料，篩選出菌絲干重和胞內(nèi)、外多糖收率高的適宜大生產(chǎn)的樺褐孔菌菌株及及發(fā)酵配方，為大規(guī)模液體發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌菌絲體及其多糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樺褐孔菌菌株

試驗(yàn)的5個(gè)樺褐孔菌菌株見(jiàn)表1，由黑龍江省科學(xué)院食用菌菌種保藏中心提供[16]。

表1 樺褐孔菌試驗(yàn)菌株

1.1.2 試驗(yàn)碳、氮源

碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、CMC（羧甲基纖維素）、糊精、纖維二糖、CMC-Na（羧甲基纖維鈉）。

氮源：蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉、麩皮、酵母膏、KNO3、牛肉膏。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基cPDA：馬鈴薯200 g/L（煮汁1000 mL），瓊脂粉14.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨0.5 g/L，磷酸二氫鉀 3.0 g/L，硫酸鎂 1.5 g/L，VB110.0 mg/L，pH自然。

發(fā)酵種子液培養(yǎng)基、菌株比較培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基：碳源20.0 g/L，酵母膏4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

葡萄糖復(fù)合碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基：碳源10.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基：氮源4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

酵母膏復(fù)合氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基：氮源2.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L；H2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌菌種的復(fù)壯

實(shí)驗(yàn)室保藏菌株用cPDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接2次，每次25℃培養(yǎng)10 d。

1.2.2 種子液培養(yǎng)

按配方配制種子液培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝100 mL，110℃滅菌20 min，冷卻后接入復(fù)壯的母種。每瓶用滅菌的自制接種針接種2.0 mm×2.0 mm大小的菌絲體10塊，溫度27℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)5 d，為發(fā)酵種子液。

1.2.3 菌球直徑及菌絲體干重測(cè)定

將種子液按10%（V∶V）接種量轉(zhuǎn)入各不同發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度27℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時(shí)間7 d，鏡檢無(wú)雜菌，布氏漏斗抽濾收集菌絲和發(fā)酵液，菌絲用ddH2O洗滌至濾液澄清，60℃干燥箱烘至恒重，稱(chēng)重為菌絲體干重。將發(fā)酵菌液倒入培養(yǎng)皿中，隨機(jī)取20個(gè)菌球排成一行測(cè)量總長(zhǎng)度，精確至1.0 mm，以菌球平均直徑計(jì)算菌球的大小，3次重復(fù)。平均直徑（mm）=菌球總長(zhǎng)度（mm）/菌球個(gè)數(shù)（個(gè)）。

1.2.4 碳源、氮源篩選試驗(yàn)

按配方制備碳源和復(fù)合碳源培養(yǎng)基，氮源和復(fù)合氮源培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝100 mL，接10%（V∶V）種子液，每個(gè)配方3次重復(fù)。搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度27℃培養(yǎng)7 d，鏡檢無(wú)雜菌后，布氏漏斗抽濾收集菌絲和發(fā)酵液。

觀察記錄菌球顏色、大小、菌球邊緣整齊度、均一度、菌絲干重，測(cè)定菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖，并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.5 復(fù)合碳、氮源正交試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)確定的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最佳條件基礎(chǔ)上，選用葡萄糖、麥芽糖、豆粉、酵母膏四個(gè)因素，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)（表2），以菌絲體干重為目標(biāo)參數(shù)，結(jié)合胞內(nèi)、外多糖含量，確定深層發(fā)酵的復(fù)合碳、氮源比例，篩選出高效發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1.2.6 多糖的提取測(cè)定

布氏漏斗抽濾發(fā)酵菌絲液，濾液部分80℃加熱濃縮至1/4體積，加入4倍體積95%的乙醇，攪拌均勻，4℃沉淀過(guò)夜，8000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2次，離心得沉淀，冷凍干燥得發(fā)酵液粗多糖。菌絲體60℃干燥至恒重，小型中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)120目篩，稱(chēng)取1.000 g，離心管中按體積比1∶5加入菌粉、雙蒸餾水，冰浴超聲5 s間歇5 s超聲5 min，95℃水浴加熱2 h，冷卻后8000 r/min離心10 min，收集上清液，向離心管中加入雙蒸餾水，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，真空濃縮定容至20 mL。加入4倍體積95%乙醇，充分?jǐn)嚢杌靹?，在溫?℃沉淀過(guò)夜，8000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2次，離心得沉淀，冷凍干燥得菌絲體多糖。多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[17]。

表2 深層發(fā)酵碳、氮源正交優(yōu)化L9（34）設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樺褐孔菌菌株的液體培養(yǎng)性狀比較

5個(gè)供試樺褐孔菌菌株液體發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，供試菌株在菌球數(shù)量和菌球直徑上差異不顯著（P＜0.05），但在形態(tài)上有差別。In 4菌株菌球小而蓬松，數(shù)量多、生長(zhǎng)快，大小均勻，發(fā)酵液顏色淡黃色，菌絲干重12.41 mg/mL，較In 1菌株高96%。其次是In 3菌株，除菌球直徑較大外，與In 4菌株差異較小，菌絲干重是In 4菌株的92.8%。In 1菌株表現(xiàn)不佳，菌球大小不均勻、不規(guī)則，發(fā)酵液顏色最深，菌絲干重最低，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。菌絲干重In 3菌株與In 4、In 5菌株差異不顯著，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。

In 4菌株發(fā)酵液多糖含量最高，達(dá)6.95 mg/mL，比In 1菌株高90%，In 1菌株發(fā)酵液多糖含量最低。In 2、In 3、In 5菌株發(fā)酵液多糖含量差異不顯著，其他菌株間差異顯著（P＜0.05）。菌絲體多糖含量最高的是In 3菌株，其次是In 4菌株，In 1菌株菌絲體多糖含量最低，僅是In 3菌株的62%，各菌株菌絲體多糖含量差異顯著（P＜0.05）。綜合發(fā)酵結(jié)果，In 4菌株優(yōu)勢(shì)顯著，碳、氮源篩選用In 4菌株。

2.2 單一碳、氮源對(duì)菌絲干重的影響

液體培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，纖維二糖為碳源菌絲體最多，其次是葡萄糖，果糖、麥芽糖再次之。CMC-Na為碳源菌絲少，菌絲干重僅為纖維二糖的21.3%。顯著性分析表明，纖維二糖、葡萄糖為碳源兩者菌絲干重差異不顯著，與其他碳源差異顯著（P＜0.05）。

表3 供試樺褐孔菌菌株液體培養(yǎng)性狀比較

表4 單一碳、氮源對(duì)菌絲干重的影響（菌株In 4）

表5 復(fù)合碳、氮源對(duì)菌絲體收率的影響（菌株In 4）

豆粉作為氮源菌絲體干重大，但發(fā)酵后培養(yǎng)基中含有一定量的豆粉殘?jiān)?，菌球收集清洗困難，大規(guī)模發(fā)酵不宜用豆粉。酵母膏為氮源效果也很好，KNO3為氮源無(wú)菌球生成，硝酸鈉和尿素為氮源菌絲產(chǎn)量低。顯著性分析表明：蛋白胨、牛肉膏菌絲體干重差異不顯著，其他氮源處理間差異顯著（P＜0.05）?？紤]到纖維二糖成本高，豆粉殘?jiān)幚韱?wèn)題，因此以葡萄糖和酵母膏為基礎(chǔ)碳、氮源與其他碳、氮源進(jìn)行復(fù)合碳、氮源篩選。

2.3 復(fù)合碳、氮源對(duì)菌絲干重的影響

葡萄糖、麥芽糖培養(yǎng)基菌絲體最多，達(dá)16.35 mg/mL，其次是纖維二糖，這2個(gè)復(fù)合碳源配方菌絲干重均高于對(duì)應(yīng)的單一碳源組。果糖、可溶淀粉、乳糖復(fù)合碳源的菌絲干重低于對(duì)應(yīng)的單一碳源的菌絲干重，其他復(fù)合碳源處理組菌絲干重都高于對(duì)應(yīng)的單一碳源組，CMC-Na復(fù)合碳源菌絲干重最低。

酵母膏、黃豆粉復(fù)合氮源菌絲干重高于單一酵母膏氮源組，且發(fā)酵后培養(yǎng)基中豆粉殘?jiān)鼛缀蹩床灰?jiàn)，便于菌絲清洗。除蛋白胨復(fù)合氮源組菌絲干重略低于其對(duì)應(yīng)的單一氮源組外，其他復(fù)合氮源菌絲干重均高于對(duì)應(yīng)的單一氮源。

顯著性分析表明，果糖、CMC復(fù)合碳源組間菌絲干重差異不顯著，其他復(fù)合碳源處理差異顯著（P＜0.05）。牛肉膏、酵母粉復(fù)合氮源組菌絲干重差異不顯著，其他處理組菌絲產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)篩選的復(fù)合碳源為葡萄糖、麥芽糖，復(fù)合氮源為黃豆粉、酵母膏，確立了正交復(fù)合配方篩選4因素。

表6 復(fù)合碳、氮源L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（菌株In 4）

2.4 復(fù)合碳、氮源L9（34）正交試驗(yàn)

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，3、7、8組菌球數(shù)量多，直徑小，顏色淡，菌球均勻。1組菌球直徑大，菌球大小不均，顏色深。5組菌球數(shù)也較少。菌絲干重第9組最高，達(dá)22.04 mg/mL，發(fā)酵液多糖最高達(dá)11.3 mg/mL。其次是第8組，菌絲收率20.66 mg/mL，菌絲體多糖含量最高達(dá)136.9 mg/g，1組發(fā)酵產(chǎn)物收率最低，菌絲干重、菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖分別是9組的31%、30%和38%。差異顯著性分析表明：第9組除與8組菌絲多糖差異不顯著外，在菌絲干重和發(fā)酵液多糖含量上較其他組差異顯著，其他各組間差異顯著（P＜0.05）。正交組合分析：4因素中以A因素（麥芽糖）級(jí)差最大，其對(duì)發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響最大，C因素（酵母膏）的影響最小。最優(yōu)條件是：A3B3D1C2，即1.5%麥芽糖，1.5%葡萄糖，0.2%酵母膏及0.06%的豆粉效果最佳。

3 小結(jié)與討論

樺褐孔菌野生資源短缺，解決這一問(wèn)題已經(jīng)迫在眉睫，除了加大人工栽培技術(shù)研究力度外，液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)樺褐孔菌菌絲體是解決樺褐孔菌原材料不足的重要途徑[18]。

黃玲對(duì)2個(gè)樺褐孔菌菌株的發(fā)酵比較發(fā)現(xiàn)，兩菌株的菌絲體及粗多糖產(chǎn)量差異極顯著[19]，這一結(jié)果與本研究相符合。供試5個(gè)菌株間無(wú)論是發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體性狀，還是發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量上差異明顯。In 4菌株發(fā)酵性狀表現(xiàn)優(yōu)良，菌絲產(chǎn)量最高，菌絲干重與除In 3菌株外其他菌株差異顯著，而發(fā)酵液多糖和菌絲體多糖均高于供試其他菌株且差異顯著（P＜0.05）。

樺褐孔菌能利用的碳源較多，單糖、雙糖、大分子化合物均可，而氮源中有機(jī)氮源遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，可能是有機(jī)氮中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、游離的氨基酸以及少量的脂肪、微量元素和生長(zhǎng)素等，有利于菌絲體的生長(zhǎng)和各種代謝產(chǎn)物的合成[20]。研究開(kāi)展單一成分和復(fù)合碳、氮源篩選，目的是考察不同營(yíng)養(yǎng)及多重營(yíng)養(yǎng)因素下，盡可能地獲得最多發(fā)酵產(chǎn)物。不同的碳、氮源，菌絲體的生長(zhǎng)及各種代謝產(chǎn)物的合成量有影響，無(wú)論是以培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體還是以多糖產(chǎn)量為目的，都可以篩選出廉價(jià)易得的培養(yǎng)原料。研究中纖維二糖為單一碳源菌絲干重雖高，但是成本較高，不適用于大生產(chǎn)。豆粉雖然廉價(jià)但殘?jiān)幚砝щy，作為有機(jī)氮，可減少用量來(lái)滿(mǎn)足高效發(fā)酵之需。研究在單一碳、氮源篩選基礎(chǔ)上，完成兩組碳、氮源復(fù)合配方正交試驗(yàn)，獲得一個(gè)高產(chǎn)配方：麥芽糖15.0 g/L，葡萄糖15.0 g/L，豆粉 0.6 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO41.5 g/L，VB110 mg/L，起始pH4.0。該配方發(fā)酵周期7 d，獲得菌絲干重22.0 mg/L，發(fā)酵液多糖11.3 mg/L，菌絲體多糖132.2 mg/L，試驗(yàn)結(jié)果為大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。