榮芮，李婷婷，張玉云，顧穎,，夏寧邵,，李少偉,

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昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在疫苗研究中的應(yīng)用進(jìn)展

榮芮1，李婷婷1，張玉云2，顧穎1,2，夏寧邵1,2，李少偉1,2

1 廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361102 2 廈門(mén)大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102

榮芮, 李婷婷, 張玉云, 等. 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在疫苗研究中的應(yīng)用進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 577–588.Rong R, Li TT, Zhang YY, et al. Progress in vaccine development based on baculovirus expression vector system. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 577–588.

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (Baculovirus expression vector system，BEVS)已成功應(yīng)用于多種蛋白的表達(dá)，并為疫苗開(kāi)發(fā)提供了充足的原材料。相比其他表達(dá)系統(tǒng)，BEVS具有許多優(yōu)勢(shì)：桿狀病毒專(zhuān)一寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物，安全性高；重組蛋白表達(dá)水平高；可對(duì)重組蛋白進(jìn)行正確折疊和翻譯后修飾，獲得具有生物活性的蛋白；適應(yīng)于多基因表達(dá)如病毒樣顆粒 (Virus-like particle) 的復(fù)雜設(shè)計(jì)；適用于大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)等。為了更好地理解BEVS在疫苗研究中的應(yīng)用前景，文中將從BEVS的發(fā)展及其在疫苗研究中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

桿狀病毒，昆蟲(chóng)細(xì)胞，蛋白表達(dá)，疫苗，病毒樣顆粒

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (Baculovirus expression vector system，BEVS) 自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)后，現(xiàn)已被廣泛用于外源蛋白表達(dá)、藥物篩選、疫苗開(kāi)發(fā)、基因治療等領(lǐng)域。BEVS因其安全性高、操作簡(jiǎn)便、可用于多亞基蛋白同時(shí)表達(dá)、適用于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，具有極大的發(fā)展前景。文中將從BEVS的系統(tǒng)發(fā)展及其在疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述。

1 桿狀病毒

桿狀病毒 (Baculovirus) 是一類(lèi)雙鏈、環(huán)狀閉合、基因組大小范圍為80?180 kb的DNA病毒[1]。桿狀病毒的形態(tài)一般為棍棒狀，長(zhǎng)度為200?400 nm，寬度為40–110 nm[2]。目前已分離得到了600多種桿狀病毒，完成了近60多種桿狀病毒的全基因組測(cè)序工作。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)命名委員會(huì)第九次報(bào)告，桿狀病毒共屬一個(gè)科 (Baculoviridae)，共4個(gè)屬：甲型 (Alphabaculovirus)、乙型 (Betabaculovirus)、丙型 (Gammabaculovirus) 和丁型桿狀病毒屬 (Deltabaculovirus)，它們分別以核型多角體病毒 (Nuclear polyhedrosis virus，NPV) 或顆粒體病毒 (Granulovirus，GV) 形式感染相應(yīng)宿主[3]。此外，桿狀病毒也可依據(jù)其含有包埋型病毒 (Occlusion- derived virions，ODVs) 的多少，分為3類(lèi)：核型多角體病毒(含有較多個(gè))、顆粒型病毒(含有一個(gè))與非包埋型病毒(不含有)[4]。

其中，從苜蓿環(huán)紋夜蛾中分離出的苜蓿蠖核型多角體病毒 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV) 是目前研究最為廣泛的桿狀病毒之一，其基因組大小約為130 kb并含有154個(gè)開(kāi)放閱讀框[5]。AcNPV在其感染期內(nèi)會(huì)有2種病毒形式：包埋型病毒，介導(dǎo)病毒在不同宿主之間的傳播；芽生病毒 (Budded virions，BVs)，介導(dǎo)病毒在同一宿主中不同部位的擴(kuò)散[6]。BVs中有一種生物學(xué)功能較為突出的囊膜糖蛋白Gp64，它在病毒感染的早期和晚期均有表達(dá)，早期定位于細(xì)胞質(zhì)，隨后遷移至質(zhì)膜。當(dāng)桿狀病毒通過(guò)質(zhì)膜出芽時(shí)獲得Gp64，缺失此蛋白時(shí)，將無(wú)法完成細(xì)胞間感染[7]。此外，Gp64糖蛋白也常與外源蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，用于表面展示技術(shù)，為增強(qiáng)蛋白免疫原性、蛋白的結(jié)構(gòu)解析工作提供了有力支撐[8]。AcNPV的基因表達(dá)過(guò)程可分為4個(gè)階段：立早期、早期、晚期和極晚期，其中多角體蛋白 (Polyhedrin) 和P10 (纖維網(wǎng)絡(luò)相關(guān)) 蛋白會(huì)在極晚期大量富集。由于多角體基因(，) 和帶有強(qiáng)啟動(dòng)子且編碼蛋白為病毒擴(kuò)增的非必要組分，所以可在刪除上述基因的同時(shí)插入外源片段，誘導(dǎo)目的蛋白的大量表達(dá)[1]。

2 昆蟲(chóng)細(xì)胞

桿狀病毒的受體細(xì)胞為昆蟲(chóng)細(xì)胞。應(yīng)用較廣的細(xì)胞系主要有2種：草地夜蛾細(xì)胞系 (，)，常用及其分離株細(xì)胞[9]；粉紋夜蛾細(xì)胞系 (，)，常用商品化的High FiveTM(H5) 細(xì)胞[10]。目前根據(jù)對(duì)這幾種細(xì)胞系的報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室的工作總結(jié)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞更適合于重組病毒擴(kuò)增及包裝；因細(xì)胞直徑更大，更適用于病毒滴度空斑實(shí)驗(yàn)觀察；H5細(xì)胞更適用于分泌蛋白表達(dá)。新細(xì)胞系的建立更加豐富了BEVS的功能和應(yīng)用，例如由Protein Science Corporation生產(chǎn)并已通過(guò)FDA認(rèn)證，成功用于流感疫苗生產(chǎn)的SF+[11]。由于野生型昆蟲(chóng)細(xì)胞難以對(duì)目的蛋白進(jìn)行高甘露糖型糖基化修飾，部分科學(xué)家對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行改造，研發(fā)出可加強(qiáng)其糖基化復(fù)雜程度的TM[12]。此外，還有通過(guò)錨蛋白Vankyrin改造技術(shù)延長(zhǎng)了細(xì)胞生長(zhǎng)周期的細(xì)胞系與可以增加細(xì)胞活性及蛋白表達(dá)量的等眾多細(xì)胞系[13-14]。這些細(xì)胞均具有對(duì)AcNPV極度敏感、適應(yīng)貼壁/搖瓶/WAVE生物波浪反應(yīng)器等多種培養(yǎng)方式、適應(yīng)于無(wú)血清培養(yǎng)條件和便于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。

3 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是以桿狀病毒作為外源基因載體，以昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主進(jìn)行基因組自我擴(kuò)增與目的蛋白的表達(dá)。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體需要質(zhì)粒載體和野生型桿狀病毒整合成含有外源基因的重組桿狀病毒才能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。構(gòu)建重組桿狀病毒的關(guān)鍵在于構(gòu)建穿梭轉(zhuǎn)移載體：將目的基因插入到或啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)，因轉(zhuǎn)移載體中含有與野生型桿狀病毒進(jìn)行重組的同源序列，所以轉(zhuǎn)移載體與親本病毒DNA進(jìn)行重組時(shí)將獲得攜帶有外源基因的重組病毒。根據(jù)重組發(fā)生在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外，構(gòu)建重組桿狀病毒可分為細(xì)胞內(nèi)重組和細(xì)胞外重組兩種方式。

3.1 重組病毒的胞內(nèi)重組

細(xì)胞內(nèi)重組方式即使用轉(zhuǎn)移載體和親本桿狀病毒共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，使外源序列通過(guò)與親本桿狀病毒基因組之間的同源序列發(fā)生重組，從而得到重組病毒。早期重組一般采用野生型桿狀病毒，重組率極低。后期利用基因工程手段可在桿狀病毒基因組ORF603與ORF1629中加入多個(gè)36Ⅰ酶切位點(diǎn)，從而得到去除了某些復(fù)制必需片段的線性親本桿狀病毒，使感染細(xì)胞后含有目的片段的重組桿狀病毒的比例高達(dá)約90%[15]，BaculoGoldTM即采用這種方式。后續(xù)部分商業(yè)化試劑盒如BacMagicTM與BACTM又將必需片段ORF1629刪除，并用細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 取代結(jié)構(gòu)基因，改造后的環(huán)狀桿狀病毒能在大腸桿菌中復(fù)制卻不能在昆蟲(chóng)細(xì)胞中正常傳代。當(dāng)其與攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移載體上的外源基因就會(huì)組裝到啟動(dòng)子的下游，移除BAC并恢復(fù)ORF1629的基因功能。采用這種方法構(gòu)建的重組桿狀病毒質(zhì)粒具有穩(wěn)定性良好、儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)并保持感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的能力等優(yōu)勢(shì)[16]。

3.2 重組病毒的胞外重組

通過(guò)胞外重組的方式得到含有目的片段的重組桿狀病毒可大大提高重組桿狀病毒的準(zhǔn)確率。經(jīng)典的Bac-to-Bac系統(tǒng)通過(guò)穿梭質(zhì)粒 (pFastBacTM)、輔助質(zhì)粒 (Helper) 與桿粒 (Bacmid) 可在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)座重組，將目的基因?qū)霔U狀病毒基因組中，隨后再通過(guò)藍(lán)白斑篩選技術(shù)得到正確的重組桿狀病毒，便可直接進(jìn)行后續(xù)的病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)[6, 17]。此外，Patel等也構(gòu)建了酵母-昆蟲(chóng)細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體，他們將啤酒酵母的自主復(fù)制序列 (Autonomously replicating sequence，ARS) 和著絲點(diǎn)功能相關(guān)序列 (Centromeric sequence，CEN) 引入桿狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)基因中，使桿狀病毒能夠在酵母體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，并能夠和相應(yīng)的轉(zhuǎn)移載體發(fā)生重組。這種載體的構(gòu)建方法最快可以在10 d內(nèi)得到重組病毒，避免了繁瑣的空斑篩選，另外，此方法還能同時(shí)分離多個(gè)不同的重組子，所以是一個(gè)快速而高效的桿狀病毒表達(dá)載體篩選系統(tǒng)，但這種構(gòu)建方法的缺點(diǎn)是需要利用蔗糖密度梯度超速離心技術(shù)來(lái)確?；蚪M的穩(wěn)定性[18]。

3.3 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)化

近年來(lái)，為提高分泌蛋白的表達(dá)量，研究人員陸續(xù)開(kāi)始探索新的技術(shù)和應(yīng)用。例如在桿狀病毒基因組中敲除和基因，它們的缺失會(huì)增加分泌及膜靶向蛋白的產(chǎn)生，同時(shí)可顯著延長(zhǎng)宿主細(xì)胞的存活期[19-20]，BestBacTM、BacMagicTM、BACTM等商品化BEVS均采用此技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，敲除基因后的重組桿狀病毒對(duì)流感病毒的血球凝集素蛋白 (Hemagglutinin，HA) 和人類(lèi)獲得性免疫缺陷病毒包膜糖蛋白Gp140的分泌表達(dá)具有明顯提升作用。此外，有科學(xué)家利用病毒錨蛋白 (Viral ankyrin/Vankyrin) 共表達(dá)技術(shù)與可持續(xù)表達(dá)錨蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)情況監(jiān)測(cè)，研究結(jié)果表明此技術(shù)能有效調(diào)控病毒感染后的細(xì)胞凋亡過(guò)程，外源蛋白的表達(dá)周期可延長(zhǎng)至6 d，同時(shí)目的蛋白的產(chǎn)量顯著增加，相關(guān)載體pAcVE.02/03及細(xì)胞系均已商品化[13]。針對(duì)種類(lèi)多樣的BEVS，部分研究學(xué)者研發(fā)出了MultiBacTM與biGBacTM表達(dá)體系，它們均可通過(guò)多基因片段串聯(lián)技術(shù)表達(dá)攜帶有多個(gè)亞基的蛋白復(fù)合體，這為解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物學(xué)功能研究提供了很大支持[21-23]。2016年，Martínez-Solís等通過(guò)研究啟動(dòng)子相關(guān)功能，發(fā)現(xiàn)當(dāng)啟動(dòng)子與啟動(dòng)子連用或?qū)?dòng)子、啟動(dòng)子與第五同源區(qū)段 (Homologous region 5，hr5) 串聯(lián)使用時(shí)，會(huì)使目的蛋白的表達(dá)量大幅提升[24-25]。2018年，Zhang等向AcNPV相關(guān)載體中插入了一段可靶向凋亡蛋白酶1 (Caspase 1) 的短發(fā)卡型RNA (Short-hairpin RNA)，抑制了細(xì)胞凋亡，外源蛋白表達(dá)量明顯增加[26]。目前，應(yīng)用較為廣泛的商品化BEVS的相關(guān)信息見(jiàn)表1。

3.4 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

相比大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：1) 桿狀病毒具有較高的種屬特異性，專(zhuān)一寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物，安全性高；2) 昆蟲(chóng)細(xì)胞可對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾作用 (如糖基化、磷酸化、乙?；?[31]；3) 桿狀病毒基因組中的/基因具有強(qiáng)啟動(dòng)子，可用于完成外源蛋白的高效轉(zhuǎn)錄；4) 桿狀病毒基因組可容納大片段外源基因，據(jù)目前報(bào)道最高可容納25個(gè)外源cDNA，具有較好的可塑性[22]，多啟動(dòng)子技術(shù)也使得BEVS可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白，非常適合于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗原如病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP) 的構(gòu)建[32-33]，相比大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)，BEVS的顆粒組裝效率更高；5) 相較哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，BEVS在動(dòng)物病毒VLP研究中應(yīng)用更為廣泛，由其生產(chǎn)的疫苗在醫(yī)藥審批程序上有望通過(guò)綠色通道獲得更快的審批途徑。

表1 代表性商品化昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)匯總

4 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與疫苗研制

自1983年Smith等首次利用BEVS成功表達(dá)純化出人β-干擾素后，BEVS在近30多年來(lái)已被進(jìn)一步優(yōu)化，廣泛用于實(shí)驗(yàn)室研究及商業(yè)化生產(chǎn)，例如葛蘭素史克公司 (GlaxoSmithKline，GSK) 基于BEVS生產(chǎn)的人乳頭狀瘤病毒疫苗Cervarix?[34]和Protein Sciences Corporation生產(chǎn)的流感疫苗FluBlok?[35]。其中，VLP是一類(lèi)不含基因組或不具感染性的蛋白多聚物，VLP和真病毒顆粒的構(gòu)象與組成成分高度相似并可將抗原表位最大程度地展示在其表面。因VLP不含有病原體的遺傳物質(zhì)，所以其安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于滅活或減毒疫苗，這使VLP在疫苗研究中更具優(yōu)勢(shì)，BEVS因其具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在VLP疫苗研究和生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用前景。

4.1 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與商品化疫苗

至今為止，利用BEVS生產(chǎn)并已成功上市的疫苗有7種，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。其中由GSK公司研制的疫苗Cervarix?是利用BEVS生產(chǎn)VLP疫苗的成功代表，Cervarix?為二價(jià)苗，主要預(yù)防HPV16、18兩個(gè)型別，它是利用BEVS共表達(dá)HPV16、18型別的結(jié)構(gòu)蛋白L1 (L1蛋白為HPV顆粒表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白)，再經(jīng)自組裝形成具備免疫原性但喪失感染能力的VLP。一系列臨床試驗(yàn)也證實(shí)了Cervarix?的安全性、保護(hù)效果(除HPV16與18型別，還可對(duì)HPV31、33、53與58型別具有一定程度的交叉保護(hù)效果)、持久性(有效保護(hù)時(shí)間≥6.4年) 等[36-39]。與其他HPV預(yù)防性疫苗Gardasil?(四價(jià)，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng))、GARDASIL?(九價(jià)，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)) 與正處于臨床Ⅲ期的馨可寧(二價(jià)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)) 相比，Cervarix?具有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：1) 針對(duì)HPV16、18型別，Cervarix?在不同年齡受試組中可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遠(yuǎn)高于Gardasil?免疫組的抗血清滴度，同時(shí)也能誘導(dǎo)機(jī)體生成更多的效應(yīng)T細(xì)胞與記憶B細(xì)胞[40]；2) 相較生產(chǎn)成本低、周期短的大腸桿菌來(lái)源的馨可寧，Cervarix?幾乎不含有內(nèi)毒素，產(chǎn)品穩(wěn)定性更好，批間差更小。

利用BEVS生產(chǎn)亞單位疫苗的成功代表有FluBolk?。針對(duì)流感病毒，市面上的滅活、減毒疫苗存在著一些不足之處：利用雞胚細(xì)胞大規(guī)模制備疫苗原材料耗時(shí)長(zhǎng)；成品疫苗中可能存在致病毒株的逃逸突變、含有化學(xué)劑福爾馬林與致敏原雞卵清白蛋白的潛在危害等[41]。FluBlok?于2013年由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，用以預(yù)防流感病毒的大面積爆發(fā)。它是由Protein Sciences Corporation利用BEVS研制并已成功上市的世界上第一支針對(duì)流感病毒的三價(jià)重組疫苗 (Recombination HA vaccine，rHA vaccine)，其免疫原由3種不同流感病毒株的HA等量組合而成(3種病毒株分別來(lái)自甲型流感病毒中的H1、H3亞型與乙型流感病毒中的Y/V亞系)。臨床試驗(yàn)顯示相比同劑量的三價(jià)滅活疫苗(Trivalent inactivated vaccine，TIV)，rHA vaccine能保證在無(wú)明顯毒副作用的前提下誘導(dǎo)機(jī)體生成更高滴度的抗血清，同時(shí)也能更為有效地刺激機(jī)體進(jìn)行相關(guān)免疫應(yīng)答[11,42-44]。2016年，F(xiàn)DA又通過(guò)了Flubolk?四價(jià)流感疫苗，同時(shí)覆蓋了突發(fā)率較高的H1、H3亞型與Y/V亞系。

除人用疫苗外，BEVS在獸用疫苗領(lǐng)域也作出了較大貢獻(xiàn)，針對(duì)豬瘟病與二型豬圓環(huán)病毒，已有5種成功上市的預(yù)防性疫苗，它們的出現(xiàn)極大程度上緩解了畜牧業(yè)的生產(chǎn)成本及養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。前期，歐洲藥品管理局針對(duì)Porcilis?Pesti與BAYOVAC CSF E2?指導(dǎo)了一系列臨床評(píng)估實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明接種過(guò)其中任意一種疫苗的小豬均能有效防止豬瘟病毒在體內(nèi)的繁殖，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的小豬生長(zhǎng)狀態(tài)均良好[45-46]。B. Ingelheim與Merck Animal Health針對(duì)二型豬圓環(huán)病毒所生產(chǎn)的預(yù)防性疫苗均為亞單位疫苗，CircoFLEX?、Cirumvent?PCV與Porcilis?PCV都適用于三周齡以上的小豬，針對(duì)剛出生的小豬 (≥3 d)，可使用Cirumvent?PCV對(duì)其進(jìn)行1 mL劑量的雙針免疫策略。

4.2 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與臨床研究階段疫苗

除了已被批準(zhǔn)上市的數(shù)種疫苗，還有很多利用BEVS生產(chǎn)的疫苗候選物正處于臨床試驗(yàn)階段，詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

Ⅰ型糖尿病為一種較為常見(jiàn)的自身免疫疾病，其中谷氨酸脫羧酶 (Glutamic acid decarboxylase，GAD65) 為主要的在研靶標(biāo)[52]。2005年，Diamyd公司以人GAD65與氫氧化鋁聯(lián)合使用的方式對(duì)治療成年型糖尿病開(kāi)展了長(zhǎng)達(dá)5年的試驗(yàn)追蹤，結(jié)果表明由BEVS生產(chǎn)的GAD65具有很好的安全性并能有效緩解人體內(nèi)C肽的釋放[53]。2017年，Beam等通過(guò)貝葉斯分析法對(duì)145位受試者進(jìn)行了數(shù)據(jù)采集及分析，證實(shí)了此疫苗候選物確實(shí)能夠有效減緩受試者體內(nèi)C肽的下降速率[52]。

表2 由BEVS生產(chǎn)的已上市疫苗

表3 基于BEVS生產(chǎn)的處于臨床試驗(yàn)的人用疫苗候選物

諾瓦克病毒 (Norwalk virus) 能誘發(fā)急性腸胃炎、全身肌肉痛等不良癥狀，對(duì)公民健康造成了嚴(yán)重威脅。Ligocyte公司與Baylor College of Medicine醫(yī)療中心利用BEVS生成了Norwalk virus VLP并分別開(kāi)展了相關(guān)臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明Norwalk virus VLP具有較好安全性并能有效預(yù)防部分病毒的入侵[54-55]。

呼吸道合胞病毒 (Respiratory syncytial virus，RSV) 是誘發(fā)一系列呼吸道疾病的主要病原體之一，相關(guān)病例在小孩及老年人中較為常見(jiàn)。2012年，Novavax公司利用BEVS表達(dá)出RSV外殼表面的Fusion糖蛋白，后續(xù)將其加工成直徑約為40 nm的蛋白顆粒疫苗候選物并在棉鼠動(dòng)物模型上證實(shí)了此疫苗能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgG型中和抗體，此外還能有效抑制RSV在肺部的擴(kuò)增[56]。隨后，Novavax對(duì)其安全性及免疫原性開(kāi)展了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，相關(guān)結(jié)果表明受試者接種RSV F蛋白顆粒疫苗候選物后無(wú)明顯不良癥狀，并且最快可在7 d后檢測(cè)到相關(guān)免疫應(yīng)答[57]。

4.3 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)與臨床前疫苗

4.3.1 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在臨床前亞單位疫苗中的研究

昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于流感疫苗的生產(chǎn)研究，體系較為成熟，該系統(tǒng)對(duì)不同型別的基于HA的疫苗候選物均有較好的表達(dá)水平。大部分流感亞單位疫苗已處于臨床研究階段。近期針對(duì)禽流感病毒H6N1，Hsieh等報(bào)道了利用雙順?lè)醋永ハx(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)開(kāi)展的相關(guān)研究。他們通過(guò)使用pFastBacTM載體與細(xì)胞獲得了可進(jìn)行H6N1毒株HA1分泌表達(dá)的重組桿狀病毒，后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明此新型亞單位疫苗相較雞胚細(xì)胞來(lái)源的減毒病毒疫苗能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)生成更高滴度的抗血清[62]。這些前瞻性研究為緩解相關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)壓力，打開(kāi)相應(yīng)疫苗市場(chǎng)作出了貢獻(xiàn)。

4.3.2 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在臨床前VLP疫苗中的研究

輪狀病毒 (Rotavirus) 是造成嬰幼兒患嚴(yán)重腹瀉病的主要病原體，全球每年因感染輪狀病毒而死的兒童大約有60萬(wàn)，其中80%均發(fā)生在條件落后的國(guó)家[63]。目前，已納入國(guó)家免疫計(jì)劃的輪狀病毒疫苗有單價(jià)苗Rotarix?(GSK公司生產(chǎn)) 和五價(jià)苗Rotateq?(MSD公司生產(chǎn))，均為減毒人用疫苗[64]。此外也有針對(duì)輪狀病毒外衣殼表面主要的中和抗原VP4、VP7及其他次要抗原(VP3、 VP6與VP1等) 設(shè)計(jì)VLP用以篩選疫苗候選物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Crawford等利用BEVS表達(dá)了VP2/6/7與VP2/4/6/7這兩種VLP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們?cè)陬w粒形態(tài)與中和能力上都和野生型輪狀病毒相似，這為后續(xù)闡明輪狀病毒入胞機(jī)制和研發(fā)輪狀病毒治療性疫苗提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[65]。

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV) 為黃病毒科中的黃病毒屬，輕微感染ZIKV時(shí)可誘發(fā)發(fā)熱、斑狀丘疹等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)損害成人神經(jīng)系統(tǒng)或通過(guò)母嬰傳播造成新生兒小頭并發(fā)癥等嚴(yán)重后果。目前針對(duì)ZIKV的疫苗候選物正在積極研制中，暫無(wú)可用疫苗[66-67]。2018年Dai等報(bào)道通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)共表達(dá)膜前體蛋白PrM/M與包膜蛋白E，構(gòu)建了ZIKV VLP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ZIKV VLP的免疫原性雖然略低于滅活的ZIKV，但也仍能刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1與Th2類(lèi)免疫反應(yīng)，激發(fā)小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞大量富集，這對(duì)病毒的清除是至關(guān)重要的。此外，ZIKV VLP可刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的IgG型中和抗體，這也為后續(xù)的疫苗研發(fā)提供了新的研究思路[68]。

手足口病是一種在幼童中較為常見(jiàn)并具有高致病性的傳染性疾病，主要由腸道病毒71 (Enterovirus 71，EV71) 與科薩克病毒(Coxsackieviruses) A16、A6和A10引起。最近，Zhang等利用BEVS構(gòu)建了EV71/CVA6/CVA10/CVA16四價(jià)VLP疫苗候選物并針對(duì)其免疫原性、交叉保護(hù)效果與持久性等方面開(kāi)展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四價(jià)VLP疫苗候選物相較單價(jià)VLP疫苗能刺激小鼠體內(nèi)型特異性的長(zhǎng)時(shí)間免疫應(yīng)答，當(dāng)小鼠被動(dòng)免疫此疫苗時(shí)，能有效預(yù)防單種或多種病毒混合物的入侵[69]。

4.4 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表面展示技術(shù)在疫苗中的應(yīng)用

BEVS表面展示技術(shù)一般通過(guò)目的蛋白與病毒衣殼蛋白Gp64融合表達(dá)的方式將外源蛋白成功展示在病毒表面，此技術(shù)具有可指定展示部分功能性表位、增強(qiáng)蛋白免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，并為藥物高通量篩選、臨床診斷治療、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域提供了便利。Yoshida等針對(duì)瘧疾構(gòu)建了AcNPV- CSPsurf重組桿狀病毒，成功將伯氏瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子蛋白與桿狀病毒外殼上的Gp64融合表達(dá)[70]。此外，BEVS表面展示技術(shù)在流感病毒、腸道病毒等相關(guān)領(lǐng)域也有不少發(fā)現(xiàn)，為相關(guān)疫苗候選物的開(kāi)發(fā)工作提供了更多選擇[71-73]。2017年，Lee等利用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得了Bac-RSVM2重組桿狀病毒，從而誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)生成了大量CD8+T細(xì)胞[74]。2016年，Sim等利用BEVS構(gòu)建了rBac-HA重組桿狀病毒，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)rBac-HA能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答并對(duì)其他亞型的流感病毒具有廣譜保護(hù)效果[75]。

5 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)近40年的發(fā)展，昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (BEVS) 已成為外源重組蛋白表達(dá)的有力工具。目前較為前沿的研究中，基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)VLP或亞單位疫苗進(jìn)行設(shè)計(jì)，再利用BEVS進(jìn)行抗原制備及相關(guān)研究已逐見(jiàn)報(bào)道。載體設(shè)計(jì)的優(yōu)化、部分基因的敲除/敲入與重組病毒分離技術(shù)的簡(jiǎn)化均加快了疫苗前期的開(kāi)發(fā)流程，此外，闡明桿狀病毒如何利用宿主細(xì)胞進(jìn)行自身復(fù)制的機(jī)制、促進(jìn)重組桿狀病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)更為高效地進(jìn)行目的蛋白的自折疊及糖側(cè)鏈的加工修飾依舊是擴(kuò)大BEVS應(yīng)用前景的關(guān)鍵之處。隨著分子生物學(xué)技術(shù)手段的快速進(jìn)步與醫(yī)藥行業(yè)的蓬勃發(fā)展，期望BEVS能借助其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在蛋白制備、疫苗研發(fā)、蛋白結(jié)構(gòu)解析及藥物設(shè)計(jì)等方面為人類(lèi)健康作出更多貢獻(xiàn)。

[1] Kong M, Zuo H, Zhu FF, et al. The interaction between baculoviruses and their insect hosts. Dev Comp Immunol, 2018, 83: 114–123.

[2] Liu YP, Wang FH, Sun ZJ, et al. Progress of studies and application on baculovirus expression vector system. Chin Bull Entomol, 2006, 43(1): 1–5 (in Chinese). 劉永平, 王方海, 蘇志堅(jiān), 等. 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的研究及應(yīng)用. 昆蟲(chóng)知識(shí), 2006, 43(1): 1–5.

[3] King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, et al. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. London: Elsevier, 2012.

[4] Blissard GW, Rohrmann GF. Baculovirus diversity and molecular biology. Annu Rev Entomol, 1990, 35: 127–155.

[5] Smith GE, Summers MD, Fraser MJ. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol, 1983, 3(12): 2156–2165.

[6] Sokolenko S, George S, Wagner A, et al. Co-expression vs. co-infection using baculovirus expression vectors in insect cell culture: benefits and drawbacks. Biotechnol Adv, 2012, 30(3): 766–781.

[7] Feng M, Wu XF. Research progresses in the interaction between baculovirus envelope protein gp64 and host cell surface factors. Sci Seric, 2014, 40(5): 911–916 (in Chinese). 馮敏, 吳小峰. 昆蟲(chóng)桿狀病毒囊膜蛋白GP64與宿主細(xì)胞表面因子互作的研究綜述. 蠶業(yè)科學(xué), 2014, 40(5): 911–916.

[8] Hu YC, Yao K, Wu TY. Baculovirus as an expression and/or delivery vehicle for vaccine antigens. Expert Rev Vaccines, 2008, 7(3): 363–371.

[9] Lee GJ, Lee SH, Lee YJ, et al. Nanostructural characterization of Sf9 cells during virus-like particles generation. Scanning, 2016, 38(6): 735–742.

[10] Krammer F, Schinko T, Palmberger D, et al.cells (High FiveTM) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol Biotechnol, 2010, 45(3): 226–234.

[11] Baxter R, Patriarca PA, Ensor K, et al. Evaluation of the safety, reactogenicity and immunogenicity of FluBlok?trivalent recombinant baculovirus- expressed hemagglutinin influenza vaccine administered intramuscularly to healthy adults 50–64 years of age. Vaccine, 2011, 29(12): 2272–2278.

[12] Legardinier S, Klett D, Poirier JC, et al. Mammalian-like nonsialyl complex-type N-glycosylation of equine gonadotropins in MimicTMinsect cells. Glycobiology, 2005, 15(8): 776–790.

[13] Steele KH, Stone BJ, Franklin KM, et al. Improving the baculovirus expression vector system with vankyrin-enhanced technology. Biotechnol Prog, 2017, 33(6): 1496–1507.

[14] Hashimoto Y, Zhang S, Zhang SY, et al. Erratum to: BTI-Tnao38, a new cell line derived from,is permissive for AcMNPV infection and produces high levels of recombinant proteins. BMC Biotechnol, 2012, 12: 12.

[15] Kitts PA, Possee RD. A method for producing recombinant baculovirus expression vectors at high frequency. Biotechniques, 1993, 14(5): 810–817.

[16] Hitchman RB, Possee RD, King LA. Baculovirus expression systems for recombinant protein production in insect cells. Recent Pat Biotechnol, 2009, 3(1): 46–54.

[17] Luckow VA, Lee SC, Barry GF, et al. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in. J Virol, 1993, 67(8): 4566–4579.

[18] Patel G, Nasmyth K, Jones N. A new method for the isolation of recombinant baculovirus. Nucleic Acids Res, 1992, 20(1): 97–104.

[19] Kaba SA, Salcedo AM, Wafula PO, et al. Development of a chitinase and v-cathepsin negative bacmid for improved integrity of secreted recombinant proteins. J Virol Methods, 2004, 122(1): 113–118.

[20] Ishimwe E, Hodgson JJ, Passarelli AL. Expression of the Cydia pomonella granulovirus matrix metalloprotease enhances Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus virulence and can partially substitute for viral cathepsin. Virology, 2015, 481: 166–178.

[21] Bieniossek C, Imasaki T, Takagi Y, et al. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem Sci, 2012, 37(2): 49–57.

[22] Weissmann F, Petzold G, VanderLinden R, et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(19): E2564–E2569.

[23] Zhang ZG, Yang J, Barford D. Recombinant expression and reconstitution of multiprotein complexes by the USER cloning method in the insect cell-baculovirus expression system. Methods, 2016, 95: 13–25.

[24] Martínez-Solís M, Gómez-Sebastián S, Escribano JM, et al. A novel baculovirus-derived promoter with high activity in the baculovirus expression system. PeerJ, 2016, 4(11): e2183.

[25] Bleckmann M, Schürig M, Chen FF, et al. Identification of essential genetic baculoviral elements for recombinant protein expression by transactivation in Sf21 insect cells. PLoS ONE, 2016, 11(3): e0149424.

[26] Zhang XY, Xu KY, Ou YM, et al. Development of a baculovirus vector carrying a small hairpin RNA for suppression of sf-caspase-1 expression and improvement of recombinant protein production. BMC Biotechnol, 2018, 18: 24.

[27] Liu Q, Ding C. Advances in research of partial functional genes of baculovirus. Chin J Virol, 2001, 17(2): 183–187 (in Chinese). 劉強(qiáng), 丁翠. 桿狀病毒部分功能基因的研究進(jìn)展. 病毒學(xué)報(bào), 2001, 17(2):183–187.

[28] Berger I, Fitzgerald DJ, Richmond TJ. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat Biotechnol, 2004, 22(12): 1583–1587.

[29] Hitchman RB, Possee RD, Crombie AT, et al. Genetic modification of a baculovirus vector for increased expression in insect cells. Cell Biol Toxicol, 2010, 26(1): 57–68.

[30] Keil GM, Pollin R, Müller C, et al. BacMam platform for vaccine antigen delivery//Brun A, Ed. Vaccine Technologies for Veterinary Viral Diseases. New York: Humana Press, 2016: 105–119.

[31] Drugmand JC, Schneider YJ, Agathos SN. Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnol Adv, 2012, 30(5): 1140–1157.

[32] Vicente T, Rold?o A, Peixoto C, et al. Large-scale production and purification of VLP-based vaccines. J Invertebr Pathol, 2011, 107(S1): S42–S48.

[33] Mena JA, Kamen AA. Insect cell technology is a versatile and robust vaccine manufacturing platform. Expert Rev Vaccines, 2011, 10(7): 1063–1081.

[34] Cutts FT, Franceschi S, Goldie S, et al. Human papillomavirus and HPV vaccines: a review. Bull World Health Organ, 2007, 85(9): 719–726.

[35] Cox MMJ, Patriarca PA, Treanor J. FluBlok, a recombinant hemagglutinin influenza vaccine. Influenza Other Respi Viruses, 2008, 2(6): 211–219.

[36] Harper DM, Franco EL, Wheeler C, et al. Efficacy of a bivalent L1 virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randomised controlled trial. Lancet, 2004, 364(9447): 1757–1765.

[37] Harper DM, Franco EL, Wheeler CM, et al. Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a randomised control trial. Lancet, 2006, 367(9518): 1247–1255.

[38] Paavonen J, Jenkins D, Bosch FX, et al. Efficacy of a prophylactic adjuvanted bivalent L1 virus-like- particle vaccine against infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: an interim analysis of a phase III double-blind, randomised controlled trial. Lancet, 2007, 369(9580): 2161–2170.

[39] Paavonen J, Naud P, Salmerón J, et al. Efficacy of human papillomavirus (HPV)-16/18 AS04-adjuvanted vaccine against cervical infection and precancer caused by oncogenic HPV types (PATRICIA): final analysis of a double-blind, randomised study in young women. Lancet, 2009, 374(9686): 301–314.

[40] Schwarz TF. Clinical update of the AS04-Adjuvanted human Papillomavirus-16/18 cervical cancer vaccine, cervarix?. Adv Ther, 2009, 26(11): 983–998.

[41] Cox MMJ, Izikson R, Post P, et al. Safety, efficacy, and immunogenicity of Flublok in the prevention of seasonal influenza in adults. Ther Adv Vaccines, 2015, 3(4): 97–108.

[42] Karch CP, Burkhard P. Vaccine technologies: from whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochem Pharmacol, 2016, 120: 1–14.

[43] Keitel WA, Treanor JJ, El Sahly HM, et al. Comparative immunogenicity of recombinant influenza hemagglutinin (rHA) and trivalent inactivated vaccine (TIV) among persons ≥65 years old. Vaccine, 2009, 28(2): 379–385.

[44] Treanor JJ, El Sahly H, King J, et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok?) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine, 2011, 29(44): 7733–7739.

[45] Uttenthal ?, Le Potier MF, Romero L, et al. Classical swine fever (CSF) marker vaccine: trial I. Challenge studies in weaner pigs. Vet Microbiol, 2001, 83(2): 85–106.

[46] Depner KR, Bouma A, Koenen F, et al. Classical swine fever (CSF) marker vaccine: trial II. Challenge study in pregnant sows. Vet Microbiol, 2001, 83(2): 107–120.

[47] van Oirschot JT. Vaccinology of classical swine fever: from lab to field. Vet Microbiol, 2003, 96(4): 367–384.

[48] Moormann RJM, Bouma A, Kramps JA, et al. Development of a classical swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test. Vet Microbiol, 2000, 73(2/3): 209–219.

[49] Fachinger V, Bischoff R, Jedidia SB, et al. The effect of vaccination against porcine circovirus type 2 in pigs suffering from porcine respiratory disease complex. Vaccine, 2008, 26(11): 1488–1499.

[50] Segalés J. Best practice and future challenges for vaccination against porcine circovirus type 2. Expert Rev Vaccines, 2015, 14(3): 473–487.

[51] Blanchard P, Mahé D, Cariolet R, et al. Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins. Vaccine, 2003, 21(31): 4565–4575.

[52] Beam CA, MacCallum C, Herold KC, et al. GAD vaccine reduces insulin loss in recently diagnosed type 1 diabetes: findings from a Bayesian meta-analysis. Diabetologia, 2017, 60(1): 43–49.

[53] Agardh CD, Lynch KF, Palmér M, et al. GAD65 vaccination: 5 years of follow-up in a randomised dose-escalating study in adult-onset autoimmune diabetes. Diabetologia, 2009, 52(7): 1363–1368.

[54] El-Kamary SS, Pasetti MF, Mendelman PM, et al. Adjuvanted intranasal norwalk virus-like particle vaccine elicits antibodies and antibody-secreting cells that express homing receptors for mucosal and peripheral lymphoid tissues. J Infect Dis, 2010, 202(11): 1649–1658.

[55] Atmar RL, Bernstein DI, Harro CD, et al. Norovirus vaccine against experimental human norwalk virus illness. New Engl J Med, 2011, 365(23): 2178–2187.

[56] Smith G, Raghunandan R, Wu YY, et al. Respiratory syncytial virus fusion glycoprotein expressed in insect cells form protein nanoparticles that induce protective immunity in cotton rats. PLoS ONE, 2012, 7(11): e50852.

[57] Fries L, Shinde V, Stoddard JJ, et al. Immunogenicity and safety of a respiratory syncytial virus fusion protein (RSV F) nanoparticle vaccine in older adults. Immun Ageing, 2017, 14: 8.

[58] Smith G, Liu Y, Flyer D, et al. Novel hemagglutinin nanoparticle influenza vaccine with Matrix-MTMadjuvant induces hemagglutination inhibition, neutralizing, and protective responses in ferrets against homologous and drifted A (H3N2) subtypes. Vaccine, 2017, 35(40): 5366–5372.

[59] López-Macías C, Ferat-Osorio E, Tenorio-Calvo A, et al. Safety and immunogenicity of a virus-like particle pandemic influenza A (H1N1) 2009 vaccine in a blinded, randomized, placebo-controlled trial of adults in Mexico. Vaccine, 2011, 29(44): 7826–7834.

[60] Bernstein DI, El Sahly HM, Keitel WA, et al. Safety and immunogenicity of a candidate parvovirus B19 vaccine. Vaccine, 2011, 29(43): 7357–7363.

[61] Raghunandan R, Lu HX, Zhou B, et al. An insect cell derived respiratory syncytial virus (RSV) F nanoparticle vaccine induces antigenic site II antibodies and protects against RSV challenge in cotton rats by active and passive immunization. Vaccine, 2014, 32(48): 6485–6492.

[62] Hsieh MS, He JL, Wu TY, et al. A secretary bi-cistronic baculovirus expression system with improved production of the HA1 protein of H6 influenza virus in insect cells and Spodoptera. J Immunol Methods, 2018, 459: 81–89.

[63] Dennehy PH. Rotavirus vaccines: an overview. Clin Microbiol Rev, 2008, 21(1): 198–208.

[64] Renukaradhya GJ, Meng XJ, Calvert JG, et al. Inactivated and subunit vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome: current status and future direction. Vaccine, 2015, 33(27): 3065–3072.

[65] Crawford SE, Labbé M, Cohen J, et al. Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. J Virol, 1994, 68(9): 5945–5952.

[66] Driggers RW, Ho CY, Korhonen EM, et al. Zika virus infection with prolonged maternal viremia and fetal brain abnormalities. New Engl J Med, 2016, 374(22): 2142–2151.

[67] Adams Waldorf KM, Stencel-Baerenwald JE, Kapur RP, et al. Fetal brain lesions after subcutaneous inoculation of Zika virus in a pregnant nonhuman primate. Nat Med, 2016, 22(11): 1256–1259.

[68] Dai SY, Zhang T, Zhang YF, et al. Zika virus baculovirus-expressed virus-like particles induce neutralizing antibodies in mice. Virol Sin, 2018, 33(3): 213–226.

[69] Zhang W, Dai WL, Zhang C, et al. A virus-like particle-based tetravalent vaccine for hand, foot, and mouth disease elicits broad and balanced protective immunity. Emerg Microbes Infect, 2018, 7: 94.

[70] Yoshida S, Kondoh D, Arai E, et al. Baculovirus virions displayingcircumsporozoite protein protect mice against malaria sporozoite infection. Virology, 2003, 316(1): 161–170.

[71] Prabakaran M, Velumani S, He F, et al. Protective immunity against influenza H5N1 virus challenge in mice by intranasal co-administration of baculovirus surface-displayed HA and recombinant CTB as an adjuvant. Virology, 2008, 380(2): 412–420.

[72] Deng L, Mohan T, Chang TZ, et al. Double-layered protein nanoparticles induce broad protection against divergent influenza A viruses. Nat Commun, 2018, 9: 359.

[73] Syed Musthaq S, Madhan S, Sahul Hameed AS, et al. Localization of VP28 on the baculovirus envelope and its immunogenicity against white spot syndrome virus in. Virology, 2009, 391(2): 315–324.

[74] Lee JY, Chang J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. J Microbiol, 2017, 55(11): 900–908.

[75] Sim SH, Kim JY, Seong BL, et al. Baculovirus displaying hemagglutinin elicits broad cross-protection against influenza in mice. PLoS ONE, 2016, 11(3): e0152485.

Progress in vaccine development based on baculovirus expression vector system

Rui Rong1, Tingting Li1, Yuyun Zhang2, Ying Gu1, 2, Ningshao Xia1, 2, and Shaowei Li1, 2

1 National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Disease, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China 2 State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China

Baculovirus expression vector system (BEVS) has been successfully applied to the over-expression of various proteins, thus providing sufficient materials for vaccine research. Compared to other systems, BEVS has many advantages: baculovirus solely being parasitic in invertebrates, the resultant products conferring high safety to mammalian, high expression level of recombinant proteins, preferable folding for eukaryotic protein, proper post-translational modification required for biological function, suitable for multiple genes co-expression and large-scale production with serum-free culture media. To better understand the advantages and prospective of BEVS for the vaccine research, this article will review the development of BEVS and its application on vaccine research.

baculovirus, insect cell, protein expression, vaccine, virus-like particles

10.13345/j.cjb.180301

July 18, 2018;

October 15, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. U1705283, 31670935, 81701637).

Shaowei Li. Tel: +86-592-2880620; E-mail: shaowei@xmu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. U1705283，31670935，81701637) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)