高健，趙鼎

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結(jié)核分枝桿菌多表位診斷抗原的制備

高健1, 2, 3，趙鼎1, 2, 3

1 鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 河南 鄭州 450000 2 鄭州兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000 3 河南省兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000

高健, 趙鼎. 結(jié)核分枝桿菌多表位診斷抗原的制備. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 718–725.Gao J, Zhao D. Preparation of multi-epitope recombinant diagnostic antigen of Mycobacterium tuberculosis. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 718–725.

將結(jié)核分枝桿菌 (，Mtb) 多個(gè)B細(xì)胞預(yù)測(cè)表位串聯(lián)表達(dá) (命名為B102)，并初步評(píng)價(jià)其作為診斷抗原的血清學(xué)診斷價(jià)值。將Mtb PstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6個(gè)蛋白的11個(gè)B細(xì)胞預(yù)測(cè)表位串聯(lián)，加入合適的連接臂后全基因合成；將多表位片段插入帶有TRX標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒中，在大腸桿菌BL21 (DE3) 中誘導(dǎo)表達(dá)，并利用Ni2+-Chelating親和層析和DEAE陰離子交換層析純化目的蛋白；利用Western blotting (WB) 技術(shù)對(duì)目的蛋白抗原性進(jìn)行鑒定，并建立Mtb抗體檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA技術(shù)，初步評(píng)價(jià)此方法對(duì)陰陽(yáng)血清樣本的鑒別能力。目的蛋白以包涵體形式存在，其表達(dá)量約占菌體總蛋白的31.25%，經(jīng)純化及復(fù)性后蛋白B102可溶性存在，濃度為3.124 mg/mL，純度為96.71%；WB實(shí)驗(yàn)表明目的蛋白能與Mtb陽(yáng)性血清相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)。對(duì)60份Mtb陽(yáng)性血清及60份Mtb陰性血清進(jìn)行檢測(cè)得出其靈敏度為90.00%，特異性為93.33%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.10%，陰性預(yù)測(cè)值為90.32%，符合率為91.67%，McNemer檢驗(yàn)的結(jié)果提示與“金標(biāo)準(zhǔn)”診斷結(jié)果無(wú)差異，Kappa=0.833，提示兩種方法診斷結(jié)果一致性優(yōu)異。原核表達(dá)與層析純化可以獲取抗原性優(yōu)異的Mtb多表位診斷抗原，作為診斷抗原可以應(yīng)用于Mtb的血清學(xué)檢測(cè)中。

多表位抗原，結(jié)核分枝桿菌，原核表達(dá)，層析純化，血清學(xué)診斷

結(jié)核病(Tuberculosis，TB) 嚴(yán)重危害人類健康，我國(guó)是全球第三大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家[1]，隨著耐藥結(jié)核日趨嚴(yán)重，結(jié)核病的預(yù)防控制勢(shì)在必行。缺乏理想的診斷技術(shù)是其防控的主要難題。目前結(jié)核病的診斷以細(xì)菌學(xué)檢查為“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要包括痰涂片鏡檢法與痰結(jié)核菌培養(yǎng)法，但存在對(duì)樣本質(zhì)量要求高、涂片靈敏度低、培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、操作誤差較大、不易標(biāo)準(zhǔn)化且無(wú)法區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌等問題[2]。皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)很難將結(jié)核菌活動(dòng)感染和潛伏感染以及卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG) 免疫個(gè)體區(qū)分開來(lái)[3]。分子檢測(cè)技術(shù)如PCR、核酸探針、生物芯片、蛋白芯片等技術(shù)操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)儀器依賴性高，需要專業(yè)技術(shù)人員，不適宜用于大樣本檢測(cè)[4]。結(jié)核分枝桿菌(，Mtb) 免疫學(xué)診斷技術(shù)由于簡(jiǎn)便、快捷、成本低、靈敏性和特異性較高廣泛用于結(jié)核病的早期診斷[5]。目前市面上血清學(xué)診斷試劑盒敏感性和特異性存在很大差異，分別為10%–90%和47%–100%[6]。因此篩選結(jié)核分枝桿菌高靈敏性和高特異性抗原成分，是解決結(jié)核病早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷的關(guān)鍵途徑。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用一種Mtb蛋白，由于單一抗體含量低或/和單一抗原分期出現(xiàn)，診斷價(jià)值不高[7–9]。也有研究表達(dá)多個(gè)蛋白，將其混合后作為診斷抗原，大大提高其診斷價(jià)值[10-12]。本研究根據(jù)篩選出通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)Mtb PstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6個(gè)蛋白的11個(gè)B細(xì)胞預(yù)測(cè)表位串聯(lián)表達(dá)，并采用Western blotting和ELISA技術(shù)對(duì)其抗原性及診斷潛能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為結(jié)核病早期診斷和疫苗研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞及TRX載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ以及T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。TMB底物溶液購(gòu)自天根生化科技有限公司。Chelating Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE公司。Goat anti-human IgG-HRP conjugate均購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司。Mtb陽(yáng)性血清60份分別來(lái)自河南省兒童醫(yī)院(34份)、鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(20份) 及鄭州兒童醫(yī)院(6份) 結(jié)核病患者(年齡3–27歲)，陰性血清60份為普通門診血樣(年齡2–19歲) 由河南省兒童醫(yī)院提供。陰陽(yáng)性血清樣本都經(jīng)過(guò)臨床和實(shí)驗(yàn)室確診，以肺結(jié)核患者痰細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果(痰涂片和/或痰培養(yǎng)陽(yáng)性)、影像學(xué)結(jié)果、結(jié)核菌素試驗(yàn)結(jié)果及核酸檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，即4項(xiàng)皆為陽(yáng)性結(jié)果定為陽(yáng)性血清，4項(xiàng)皆為陰性結(jié)果定為陰性血清。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒B102的構(gòu)建

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，將Mtb Pst1 aa 58–73 & aa 176–206 & aa 337–362、ESTA6 aa 15–30 & aa 44–59、CFP10 aa 18–33 & aa 60–84、Ag85B aa 119–134、Ag85A aa 214–230以及PPE54 aa 422–438 & aa 1825–1851用GGGS連接臂進(jìn)行串聯(lián)，然后根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好表優(yōu)化基因并在5′端添加Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，3′端添加Ⅰ酶切位點(diǎn)序列，最后交由TaKaRa全基因合成(將基因片段命名為B102F)。用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ處理包含B102F的pMD19-T-B102F質(zhì)粒(全基因合成產(chǎn)物)，將B102F酶切下來(lái)，連接到相同酶切處理的TRX表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單克隆菌落進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，提取陽(yáng)性表達(dá)克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒命名為B102質(zhì)粒。

1.3 蛋白B102的制備

將轉(zhuǎn)化B102質(zhì)粒的BL21 (DE3) 接種于含氨芐霉素(50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基(10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母提取液，10 g/L NaCl) 中，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白(34 ℃， 4 h, 2 L)。離心收集表達(dá)菌(4 000 r/min，8 min，10 ℃)。用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，0.3% Triton X-100，pH 8.0) 重懸表達(dá)菌后用超聲儀破碎(功率250 W，超聲工作時(shí)間10 s，間歇時(shí)間20 s，共40個(gè)循環(huán))，離心(12 000 r/min，8 min，10 ℃)棄去上清。沉淀再次用緩沖液A重懸后離心回收(10 000 r/min，8 min，8 ℃)。用5 mL雙蒸水重懸沉淀，逐滴加入到緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，7 mol/L鹽酸胍，pH 8.0) 中并不斷攪拌直至溶液澄清。離心(12 000 r/min，8 min，8 ℃) 收集上清。將此上清上樣于用緩沖液B平衡的Chelating Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)中。首先用60 mmol/L咪唑(溶于緩沖液B中) 進(jìn)行洗脫，然后用緩沖液C (20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)再次平衡層析介質(zhì)，然后用300 mmol/L咪唑(溶于緩沖液C中) 進(jìn)行洗脫。取300 mmol/L洗脫液于緩沖液C中進(jìn)行透析去掉咪唑成分。DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)用緩沖液C平衡后上樣，分別用0、100、200、400 mmol/L NaCl (溶于緩沖液C中) 進(jìn)行梯度洗脫并收集相應(yīng)洗脫液。分別取樣SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的含量以及分布情況。將目的蛋白含量最高。純度最好的洗脫液于PBS (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4) 中徹底透析后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白B102的Western blotting分析

上樣10 μL蛋白B102溶液在13.5% SDS-PAGE中電泳(恒流35 mA，60 min)，然后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(NC) 上(恒壓12 V，35 min)。室溫，封閉液(3%脫脂奶粉溶解于PBST)處理NC膜2 h。加入封閉液稀釋的Mtb陽(yáng)性血清(1∶20)、Mtb陰性血清(1∶20)，常溫孵育1 h后用PBST洗膜5次。檢測(cè)抗體都為Goat anti-human IgG-HRP conjugate (1∶5 000；Merck Millipore)，常溫孵育1 h后PBST洗膜5次，最后DAB顯色，清水終止顯色。

1.5 蛋白B102診斷效能的評(píng)價(jià)

利用蛋白B102建立血清Mtb抗體診斷競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒，并對(duì)臨床和實(shí)驗(yàn)室確診的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)試劑盒對(duì)陰陽(yáng)性血清標(biāo)本的鑒別能力。簡(jiǎn)言之，碳酸鹽包被緩沖液稀釋蛋白B102 (1∶3 000) 后每孔100 μL (1.041 μg/mL) 包被板條孔，200 μL封閉液封閉非特異性位點(diǎn)；加入待測(cè)血清100 μL (1∶100稀釋)，置37 ℃孵育 1 h，然后洗滌；加入100 μL B102-HRP conjugate (1∶6 000；高碘酸鹽偶聯(lián)法；1.852 μg/mL)，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌；加入100 μL TMB顯色，參考基線波長(zhǎng)為620 nm，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm吸光度值(值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 7.00軟件分析120份血清樣本的值，繪制Mtb陽(yáng)性血清與陰性血清抗體水平散點(diǎn)圖，并進(jìn)行檢驗(yàn)比較兩組血清水平差異。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選取陰性血清值均值2.1倍作為最佳臨界值(Cut-off value) 并以此判定檢測(cè)試劑盒的靈敏度和特異性。用McNemer檢驗(yàn)及Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)和層析純化可獲取高度均質(zhì)的蛋白B102

B102的構(gòu)建如圖1A所示，融合蛋白的氨基端為TRX標(biāo)簽，緊跟著依次為PstS1 (3個(gè)表位)、ESAT6 (2個(gè)表位)、CFP10 (2個(gè)表位)、Ag85B (1個(gè)表位)、Ag85A (1個(gè)表位) 以及PPE54 (2個(gè)表位) 等6個(gè)蛋白的11個(gè)B細(xì)胞預(yù)測(cè)表位，羧基端為His標(biāo)簽，間隔中添加了連接臂GGGS以及合適的酶切位點(diǎn)(如Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ)。全基因合成的多表位基因片段長(zhǎng)度約773 bp (圖1B)，構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序、小量表達(dá)(圖2A) 和雙酶切鑒定結(jié)果(圖1C) 證實(shí)構(gòu)建成功，并將正確質(zhì)粒命名為B102質(zhì)粒。

3個(gè)轉(zhuǎn)化B102質(zhì)粒的BL21 (DE3) 單克隆菌落小量表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在約40 kDa處有明顯表達(dá)條帶(圖2A)，表明B102蛋白可以在大腸桿菌中有效表達(dá)。但是蛋白B102主要以包涵體形式存在(圖2B)，占菌體總蛋白比例達(dá)到31.25%。將包涵體進(jìn)行處理后利用His親和層析進(jìn)行純化，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白B102主要存在于300 mmol/L咪唑洗脫液中(圖2B)，純度為94.25%，濃度為2.313 mg/mL。經(jīng)過(guò)DEAE陰離子交換層析后，蛋白B102主要分布于200 mmol/LNaCl洗脫液中，純度為96.71%，濃度為3.124 mg/mL (圖2B)。

圖1 B102表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 蛋白B102可以與Mtb陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)

利用Western blotting技術(shù)對(duì)蛋白B102的抗原性進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果顯示，利用Mtb陽(yáng)性血清作為捕獲抗體，抗人IgG-HRP作為檢測(cè)抗體，在NC膜上相應(yīng)位置出現(xiàn)了明顯條帶(圖3A)；而Mtb陰性血清作為捕獲抗體，在NC膜上相應(yīng)位置沒有出現(xiàn)對(duì)應(yīng)條帶。并且無(wú)論是用Mtb陽(yáng)性血清還是陰性血清，無(wú)蛋白B102表達(dá)菌及TRX空載體表達(dá)菌都未見明顯條帶(圖3，泳道1-2)，表 明了蛋白B102可以與Mtb陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖2 蛋白B102小量表達(dá)(A) 和親和層析及陰離子交換層析純化結(jié)果(B)

圖3 蛋白B102的Western blotting分析

2.3 基于蛋白B102的競(jìng)爭(zhēng)法ELISA技術(shù)可以很好地鑒別Mtb陰陽(yáng)性血清標(biāo)本

3 討論

一直以來(lái)結(jié)核分枝桿菌感染的血清學(xué)診斷是科研難題，病人不同的疾病進(jìn)程、潛伏及細(xì)胞內(nèi)感染的特性、相對(duì)繁多的結(jié)構(gòu)及非結(jié)構(gòu)蛋白等使Mtb的免疫學(xué)指標(biāo)紛呈復(fù)雜。目前有很多Mtb抗原如MPT-64、Ag85復(fù)合物和CFP-10/ ESAT-6等用于血清學(xué)診斷和疫苗研究，但靈敏度或特異性都不理想[5,13-14]。本研究根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)篩選出Mtb6個(gè)蛋白的11個(gè)表位并將多表位展示在一個(gè)蛋白上，旨在構(gòu)建表位依賴性Mtb診斷抗原。

圖4 蛋白B102在Mtb感染血清學(xué)診斷效果評(píng)價(jià)

所選取的6個(gè)蛋白分別為PstS1 (3個(gè)表位)、ESAT6 (2個(gè)表位)、CFP10 (2個(gè)表位)、Ag85B (1個(gè)表位)、Ag85A (1個(gè)表位) 以及PPE54 (2個(gè)表位)。PsttS1、Ag85A、Ag85B、ESAT-6、CFP10是感染早期大量表達(dá)的分泌蛋白[15]。PE/PPE蛋白家族為分枝桿菌所獨(dú)有，且是結(jié)核分枝桿菌基因組中一個(gè)數(shù)量龐大的家族，對(duì)分枝桿菌的內(nèi)穩(wěn)態(tài)保持、繁殖及不同環(huán)境下的生存影響有著巨大的研究潛力。而且PE/PPE蛋白作為毒力因子對(duì)抗原加工遞呈、診斷抗原和疫苗研究等方面意義重大[16]。因此本研究選用了PPE54蛋白兩個(gè)抗原性預(yù)測(cè)值較高的表位。PstS1是結(jié)核菌的主要免疫原，何秀云等發(fā)現(xiàn)此抗原檢測(cè)的特異性明顯高于PPD[17]。ESAT6和CFP10無(wú)論在Mtb的顯性感染、隱性感染還是在與HIV合并感染中都具有較好的特異性和敏感性。當(dāng)與PstS1蛋白聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，CFP10能檢測(cè)出對(duì)PstS1抗原缺乏反應(yīng)的結(jié)核病患者血清特異性抗體，在保持高特異性的基礎(chǔ)上，可以彌補(bǔ)PstS1蛋白對(duì)涂片陰性結(jié)核病患者檢測(cè)敏感性的不足[18]。Ag85復(fù)合物在活動(dòng)性肺結(jié)核病患者血清中高50–150倍，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病輔助診斷具有重要意義[19]。將這6種蛋白的優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行串聯(lián)進(jìn)而構(gòu)建出新型Mtb診斷抗原。本研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在(圖2B)，但純化后經(jīng)過(guò)透析復(fù)性，目的蛋白水溶性程度很高，主要原因有：1) TRX融合表達(dá)能提高目的蛋白的可溶性，對(duì)目的蛋白的復(fù)性可能也有幫助作用[20]；2)所選擇的B細(xì)胞預(yù)測(cè)表位為線性表位同時(shí)也是T細(xì)胞表位，對(duì)蛋白構(gòu)象的要求相對(duì)較低；3)預(yù)測(cè)表位親水程度高，容易水溶。Western blotting結(jié)果顯示蛋白B102可以與Mtb陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，理論上可以與存在表位對(duì)應(yīng)的所有抗體反應(yīng)，說(shuō)明了其抗原性優(yōu)異。

本研究采用競(jìng)爭(zhēng)法同時(shí)檢測(cè)血清中Mtb相關(guān)IgG、IgM和IgA。在Mtb感染早期，患者體內(nèi)抗體以IgM為主，中晚期以IgG型為主，而潛伏感染者及感染愈后患者體內(nèi)一定時(shí)間內(nèi)存在大量IgG抗體。有研究發(fā)現(xiàn)大量樣本檢測(cè)[21]，IgM陽(yáng)性率很低，大部分為IgG陽(yáng)性，而本研究采用的是競(jìng)爭(zhēng)法ELISA，可以同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM兩種血清學(xué)指標(biāo)，IgM抗體檢測(cè)可以補(bǔ)充IgG檢測(cè)只針對(duì)結(jié)核病中晚期的局限性，為結(jié)核病的早期診斷提供依據(jù)，針對(duì)不同的患者和不同的病程，同時(shí)檢測(cè)兩種抗體在結(jié)核病的診斷中意義重大[21]。IgA為粘膜免疫指標(biāo)，血清中IgA也是一個(gè)重要診斷指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)可以同時(shí)檢測(cè)這3種抗體的新型診斷試劑的靈敏度和特異性都很理想，下一步需要精細(xì)優(yōu)化包被抗原和酶偶聯(lián)抗原含量，靈敏度和特異性可能會(huì)有所提升。

總之，原核表達(dá)和層析純化獲取的多表位串聯(lián)診斷抗原，可以很好地鑒別Mtb陰陽(yáng)性血清，為結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷和治療提供有效的血清學(xué)依據(jù)，為結(jié)核防控工作提供更真實(shí)的決策指標(biāo)。

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Preparation of multi-epitope recombinant diagnostic antigen of

Jian Gao1, 2, 3, and Ding Zhao1, 2, 3

1Department of Laboratory Medicine, Children’s Hospital Affiliated of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000,Henan,China 2Department of Laboratory Medicine, Zhengzhou Children’s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan, China 3 Department of Laboratory Medicine, Henan Children’s Hospital, Zhengzhou 450000, Henan, China

Multi-epitope recombinant diagnostic antigen (designated ‘B102’) of(Mtb) was prepared and evaluated as a serological diagnostic antigen. With TRX at the N-terminal and His tag at the C-terminal, the multi-epitope Mtb recombinant diagnostic antigen including 11 predicted B-cell epitopes from 6 Mtb antigens (PstS1, ESAT6, CFP10, Ag85B, Ag85A and PPE54) was expressed inBL21 (DE3) and purified by Ni2+-Chelating affinity and DEAE anion exchange chromatography. Based on the antigenicity of B102 confirmed in Western blotting analysis, we constructed and evaluated a double-antigen sandwich ELISA for diagnosis of Mtb infection. The protein B102 exists in the form of inclusion bodies, accounting for 31.25% of the total proteins of the bacteria. After purification and renaturation, protein B102 exists in soluble form with the concentration 3.124 mg/mL and the homogeneity 96.71%. WB analysis demonstrated that protein B102 could react with antibodies in Mtb positive serum. Using the novel antigen in ELISA, we tested 60 Mtb-related positive and negative serum; The results showed the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values and coincidence rate of the detection method is 90.00%, 93.33%, 93.10%, 90.32% and 91.67%, respectively. The McNemer analysis suggested there was no statistical difference between the ‘Gold standard’ and the novel ELISA with kappa 0.833, which suggested the excellent consistency. By prokaryotic expression and chromatography purification, the multi-epitope recombinant antigen B102 was obtained with excellent antigenicity, which could be applied for Mtb-related serological detection.

multi-epitope recombinant diagnostic antigen,, prokaryotic expression, chromatography purification, serological diagnosis

10.13345/j.cjb.180392

September 21, 2018;

November 19, 2018

Ding Zhao. Tel/Fax: +86-371-85515776 ; E-mail: zhaoding_henan@126.com

2019-01-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190107.1101.001.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)