王 瀟，夏瑤賓*

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

引 言

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS，以下簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是一種復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機(jī)制不清，病變廣泛、形態(tài)多樣，極具侵襲性和復(fù)發(fā)性，嚴(yán)重影響婦女的健康和生活質(zhì)量[1-2]。由于雌激素是子宮內(nèi)膜異位癥病變發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素，大多數(shù)已建立的治療方法都是以產(chǎn)生一種能暫時(shí)緩解的低雌激素狀態(tài)為目標(biāo)[3]。目前，大多數(shù)用于治療內(nèi)異癥的西藥效果尚可，但具有停藥后易復(fù)發(fā)，且副作用多等弊端。因此，尋求多靶位、多環(huán)節(jié)抑制異位內(nèi)膜形成的藥物顯得尤為重要。

氣虛是中醫(yī)解釋內(nèi)異癥發(fā)生和發(fā)展的立足點(diǎn)。因此，中醫(yī)臨床治療內(nèi)異癥以活血化瘀為基本，另外輔以益氣、溫腎和清熱等法，整體療效較好[4]?；鱿惸z囊（HYXYJN）98年以來(lái)用于臨床，治療子宮內(nèi)膜異位癥，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥有明顯的療效。本研究分離子宮內(nèi)膜異位癥的離體細(xì)胞為模型，研究HYXYJN對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增長(zhǎng)的影響，探討其對(duì)內(nèi)異癥的影響機(jī)理。

1 主要試劑和儀器

胎牛血清，胰蛋白酶，膠原酶Ⅰ、DNAase，雄烯二酮，多聚甲醛，細(xì)胞培養(yǎng)板，Triton X-100，鼠抗人波形蛋白（vimentin）抗體，鼠抗人角蛋白（cytokeratin）抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG，CCK-8試劑盒，羊抗鼠IRG/PITC；流式細(xì)胞儀(BECHMAN)、倒置相差顯微鏡(ZEISS Observer.A1)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo HERACELL 150i)、多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo VARIOSKAN FLASH)。

2 病例入選標(biāo)準(zhǔn)

2015年5月～2017年12月期間，收集內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院婦科就診為子宮內(nèi)膜異位癥患者樣本，入選標(biāo)準(zhǔn)為：⑴年齡24～48歲；⑵月經(jīng)規(guī)律，周期28～32天；⑶無(wú)其它內(nèi)分泌、免疫或代謝性疾?。虎仁中g(shù)前三個(gè)月內(nèi)未接受激素治療。另外，用無(wú)菌方法通過(guò)刮宮或直接剪切留取子宮內(nèi)膜收集5例子宮肌瘤患者樣本作為對(duì)照，其子宮內(nèi)膜正常同時(shí)排除了內(nèi)異癥。非內(nèi)異癥組10例成活4例，內(nèi)異癥組8例成活5例。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞分離培養(yǎng)

將清洗干凈的組織剪碎至糊狀，依次加入0.2%膠原酶Ⅰ和20 U/mL的DNA酶進(jìn)行孵育。然后使用15%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，以1000 rPm轉(zhuǎn)速離心5 min后，棄上清。重復(fù)兩次。加入含有15%血清的培養(yǎng)液吹打均勻，接種至培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 細(xì)胞免疫熒光染色

室溫下，經(jīng)過(guò)多聚甲醛固定，TritonX-100通透和BSA封閉后，按照1:300比例滴加一抗，4eC過(guò)夜孵育。次日，棄液體，PBS清洗三次，加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1:300)，避光孵育1 h后，DAPI復(fù)染5 min，清洗制片。PBS代替一抗孵育細(xì)胞作為陰性對(duì)照，共聚焦顯微鏡觀察vimentin和cytokeratin的表達(dá)情況。

3.3 檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將原代培養(yǎng)的內(nèi)異癥和對(duì)照組內(nèi)膜細(xì)胞分別進(jìn)行消化，以4h103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入不含血清培養(yǎng)液同步化24 h。分別加入不含有和含有180 μg/ml、18 μg/ml、1.8 μg/ml HYXYJN的培養(yǎng)液200 μl，同時(shí)各孔分別加入1h10-7mol/L雄烯二酮進(jìn)行刺激。0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，檢測(cè)450 nm處測(cè)定OD值。以無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白調(diào)整本底，以時(shí)間為橫軸，光密度值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)

酶消化后，懸浮細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后開始貼壁。密度均勻。培養(yǎng)4天后，細(xì)胞融合度為85%以上，生長(zhǎng)良好。

4.2 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定

以PBS作為一抗進(jìn)行孵育為陰性對(duì)照，角蛋白和波形蛋白染色均為陽(yáng)性，表明原代培養(yǎng)細(xì)胞中同時(shí)含有上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果見圖1。另外，角蛋白熒光染色強(qiáng)度較波形蛋白染色強(qiáng)度弱，表明間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多，上皮細(xì)胞含量較少。分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中大多是間質(zhì)細(xì)胞。

圖1 免疫熒光鑒定子宮內(nèi)膜細(xì)胞

4.3 HYXYJN對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果見圖2所示。各組內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞隨HYXYJN濃度增加，抑制作用加強(qiáng)。其中，180 μg/ml濃度的HYXYJN培養(yǎng)組抑制作用最強(qiáng)；18 μg/ml和1.8 μg/ml 濃度的HYXYJN培養(yǎng)組僅在96 h時(shí)有差異，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)差異。相同時(shí)間下，內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量顯著高于非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞（P＜0.05），表明內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞的增殖速度大于非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞。

5 討 論

綜上結(jié)果表明，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖活性明顯高于非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞；平臺(tái)期時(shí)的細(xì)胞數(shù)量也明顯高于非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞。這可能與非內(nèi)異癥內(nèi)膜細(xì)胞間的接觸抑制效應(yīng)較強(qiáng)有關(guān)，細(xì)胞趨于靜止?fàn)顟B(tài)。然而，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞間接觸抑制較弱。因此，其生長(zhǎng)較為活躍，具有向腫瘤細(xì)胞過(guò)渡的趨勢(shì)，體現(xiàn)出不同于正常內(nèi)膜的“惡性”行為。整體上，HYXYJN對(duì)非內(nèi)異癥和內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖活性沒有顯著影響，僅在濃度180μg/ml作用72h、96h后對(duì)細(xì)胞的增殖活力有一定抑制作用，HYXYJN組與桂枝茯膠囊組無(wú)顯著差異。

圖2 HYXYJN對(duì)分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響