潘 虎，劉青海，田 云，達娃卓瑪，盧向陽，次 頓，白軍平

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測研究所，西藏 拉薩 850032；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

青稞(HordeumvulgareLinn.var.nudumHook.f.)是西藏第一大農(nóng)作物，是藏區(qū)農(nóng)牧民不可替代的糧食作物。西藏地處我國西南邊陲，高寒、低溫、缺氧等極端環(huán)境造就了獨特的土壤微生物群落組成，但同時也導(dǎo)致西藏土壤微生物活性下降，造成青稞農(nóng)田土壤較為貧瘠[1-2]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮、磷等元素轉(zhuǎn)換和循環(huán)的主要動力，也是土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成等生化過程的主要參與者，在整個土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著不可替代的作用[3-4]。目前，西藏地區(qū)土壤微生物群落組成的研究還處于起步階段。榮新山等[5]采用高通量測序技術(shù)對藏北退化高寒草原土壤真菌多樣性進行分析，結(jié)果表明，藏北退化高寒草原土壤真菌群落的優(yōu)勢門類主要為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)等；段雙全等[6]利用核糖體DNA限制性酶切片段多態(tài)性分析了西藏羊八井廢棄熱井沉積物中的真核微生物多樣性，結(jié)果表明，沉積物中主要的真核微生物有子囊菌、壺菌、擔子菌和非培養(yǎng)真菌等；趙墾田等[7]利用馬丁氏培養(yǎng)基從拉薩半干旱河谷砂生槐灌叢土壤中分離鑒定的優(yōu)勢真菌主要為青霉屬(Penicillium)、酵母屬 (Saccharomyces)、木霉屬(Trichoderma)和擬青霉(Paecilomyces)等，但有關(guān)青稞農(nóng)田土壤真菌區(qū)系的研究尚未見系統(tǒng)報道[8]。鑒于此，以高原特色農(nóng)作物青稞為研究對象，以青稞種植土壤為試驗材料，通過Illumina公司高通量測序技術(shù)分析青稞種植土壤中真菌的群落結(jié)構(gòu)，為青稞種植土壤真菌資源的挖掘與利用提供基礎(chǔ)信息。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

依據(jù)西藏青稞生育期，分別于2016年3月25日[播種前期(Group A)]、7月8日[灌漿期(Group B)]、9月28日[收獲后期(Group C)]在拉薩周邊選擇9塊大面積青稞種植農(nóng)田采集土壤樣品(表1)。土壤樣品采用5點取樣法，樣品混勻后用無菌塑封袋封裝[將土壤樣品編號為n-1、n-2、n-3，其中，n代表樣品采樣點(共9個采樣點)，1代表播種前期采集的樣品，2代表灌漿期采集的樣品，3代表收獲后期采集的樣品]，-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 土壤樣品采集點信息Tab.1 The sampling site information of soil samples

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品基因組DNA的提取 采用天根生化科技(北京)有限公司土壤基因組DNA提取試劑盒(DP 336)提取青稞種植農(nóng)田土壤樣品中微生物的總DNA，按說明書操作，所提取的總DNA于-20 ℃保藏備用。

1.2.2 真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)部分序列的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增及測序 用提取的總DNA為模板，采用PCR擴增真菌ITS部分序列片段。擴增引物為R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和F:5′-GCATC-GATGAAGAACGCAGC-3′[9]，PCR擴增體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、引物各1 μL、TakaRaTaq(5 U/μL) 0.25 μL、模板1 μL、無菌水37.75 μL。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物采用Min Elute PCR Purefication Kit 純化后4 ℃保存。取2 μL PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR擴增產(chǎn)物送至杭州晶佰生物科技有限公司進行測序，測序平臺為Illumina-Miseq。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用CASAVA(v 1.8.2)軟件對原始測序結(jié)果進行圖像堿基識別，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除低質(zhì)量的序列后，應(yīng)用Pandaseq(v 2.7)和Trimmomatic(v 0.33)軟件進行數(shù)據(jù)優(yōu)化分析，獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。計算在97%的相似水平上每個樣本的操作分類單元(OTUs)數(shù)量，并繪制稀釋曲線(Rarefaction curves)[10]。利用Qiime(v 1.7)軟件計算樣品包括超(Chaol)指數(shù)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)的阿爾法(α)多樣性值，Chaol指數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon指數(shù)值越高表明群落物種的多樣性越高[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中真菌群落豐富度及多樣性分析

從表2和圖1可見，所有土壤樣品真菌的稀釋曲線均已進入平臺期，所有土壤樣品的測序深度指數(shù)均在0.980以上，表明隨著測序數(shù)量的增加，發(fā)現(xiàn)新的真菌種類的概率較小，測序數(shù)據(jù)能夠較好地反映土壤樣品中真菌群落區(qū)系組成。通過Illumina高通量測序，發(fā)現(xiàn)3個不同時期樣品的Chaol指數(shù)均值和Shannon指數(shù)均值大小排序均為Group A

2.2 土壤樣品中真菌OTUs結(jié)果分析

以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，對所有OTUs的代表序列進行物種注釋后，土壤樣品中真菌群落在門水平上主要劃分為以下5類：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和接合菌門(Zygomycota)(圖2)。對土壤樣品在屬水平上的真菌的相對豐度進行分析，結(jié)果表明，接合菌門(Zygomycota)的被孢霉屬(Mortierella)，子囊菌門(Ascomycota)的足孢子菌屬(Podospora)、赤霉菌屬(Gibberella)、分子孢子菌屬(Cladosporium)和毛殼菌屬(Chaetomium)等是各樣品中在屬水平上相對豐度排名前15的主要物種，是拉薩青稞種植農(nóng)田土壤中的優(yōu)勢真菌類群(圖3)。

表2 土壤樣品中真菌的α多樣性及OTUs數(shù)量Tab.2 The α diversity and OTUs quantity of fungi in each soil sample

圖1 土壤樣品中真菌序列的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of pyrosequencing reads of fungi in each soil sample

圖2 土壤樣品門水平上主要真菌的相對豐度Fig.2 Relative abundance analysis of the major fungi in each soil sample at phylum level

圖3 土壤樣品屬水平上前15類真菌的相對豐度Fig.3 Relative abundance analysis of the top 15 fungi in each soil sample at genus level

2.3 不同采樣點土壤樣品真菌區(qū)系差異分析

對不同采樣點土壤樣品的真菌群落進行主成分(PCoA)分析，結(jié)果(圖4)表明，在Group A中樣品9-1的真菌群落組成與其他樣品差異最大，通過對屬水平的前15類真菌的相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，樣品9-1真菌群落中獨有的嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)是引起群落組成差異顯著的重要原因。在Group B中除2-2和9-2外，其他樣品的真菌群落組成差異相對一致，通過PCoA分析顯示，1-2、3-2、4-2、5-2、6-2、7-2、8-2 7個樣品單獨聚合歸為相近的一類，通過對屬水平上前15類真菌的相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，樣品2-2中真菌群落獨有的球囊霉屬(Glomus)、樣品9-2中真菌群落獨有的離蠕孢霉屬(Bipolaris)可能是引起群落真菌組成差異顯著的重要原因。在Group C中，樣品1-3、5-3、6-3的真菌群落組成差異最小，而樣品3-3、4-3分別與組內(nèi)其他樣品的真菌群落組成差異較大，通過對屬水平的前15類真菌的相對豐度比較發(fā)現(xiàn)，樣品3-3中真菌群落獨有的管柄囊霉屬(Funneliformis)、小畫線殼屬(Monographella)，樣品4-3中真菌群落獨有的蛇頸龍屬(Ophiosphaerella)和埃里格孢屬(Embellisia)可能是引起真菌群落組成差異顯著的重要原因。而Group C中的 7-3、8-3、9-3樣品真菌群落中因有油瓶霉屬(Lecythophora)被PCoA分析單獨聚合歸為一類。GroupB 內(nèi)的樣品PCoA聚合較Group A和Group C相對一致，即除2-2和9-2樣品外，Group B 內(nèi)的其他樣品真菌群落組成差異較小，說明在青稞灌漿期土壤中真菌群落具有趨同特征。

問：我在中國工作過，如果中國警察對我提出要求，我會聽從。如果今后來瑞典旅游的中國游客面臨與瑞典警察對話的情況，您對他們有什么建議？

圖4 土壤樣品中真菌群落主成分分析Fig.4 The PCoA analysis of fungi OTUs in each soil sample

2.4 不同采樣時期土壤樣品真菌區(qū)系差異分析

對Group A與Group B、Group C之間各樣品屬水平上前15類真菌差異情況進行分析(表3)，結(jié)果表明，1、5、7號樣品在不同采樣時期真菌群落組成分別在頂囊殼屬(Gaeumannomyces)、金孢子菌屬(Emmonsia)和莖點霉屬(Phoma)存在顯著差異。其中，樣品1-1真菌組成分別與1-2、1-3相比具有較多的頂囊殼屬(Gaeumannomyces)，樣品5-1真菌組成分別與5-2、5-3相比具有較多的金孢子菌屬(Emmonsia)，而樣品7-1真菌組成分別與7-2、7-3相比具有較多的莖點霉屬(Phoma)。采用多重比較法(LSD)對屬水平上各樣品真菌組間差異進行分析(表4)，結(jié)果顯示，在播種前期、 灌漿期和收獲后期，1、2、4、5、7號樣品真菌群落組成分別在金孢子菌屬(Emmonsia)、暗球腔菌屬(Phaeosphaeria)、被毛孢屬(Hirsutella)、金孢子菌屬(Emmonsia)、小毛盤菌屬(Cistella)上存在顯著差異。

表3 不同時期同一地點屬水平上前15類真菌差異分析Tab.3 Difference analysis of the top 15 fungi in same location between different periods

注：P<0.05表示各樣品間差異達顯著水平，下同。

Note:P<0.05 indicate significant differences between different samples,the same below.

表4 屬水平上土壤樣品真菌組間差異分析Tab.4 Difference analysis of fungi between groups at genus level in each soil sample

3 結(jié)論與討論

土壤微生物群落功能多樣性能描述微生物群落狀態(tài)，同時能靈敏地反映出土壤的質(zhì)量變化，土壤微生物群落功能的多樣性與均一性不僅能提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，同時也能提升土壤微生態(tài)環(huán)境的抵抗能力[12-13]。本試驗首次采用Illumina高通量測序技術(shù)對拉薩9處不同青稞種植農(nóng)田土壤進行了真菌群落結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果顯示，土壤真菌群落在門的水平上主要為子囊菌門 (Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和接合菌門(Zygomycota)，在屬的水平上主要為被孢霉屬(Mortierella)、足孢子菌屬(Podospora)、赤霉菌屬(Gibberella)、分子孢子菌屬(Cladosporium)和毛殼菌屬(Chaetomium)等，青稞灌漿期較播種前期、收獲后期真菌群落組成差異較小，其土壤真菌群落具有趨同特征。普布次仁等[14]對西藏真菌歸納統(tǒng)計結(jié)果顯示，西藏真菌總計185科551屬2 599種，其中擔子菌門、子囊菌門、球囊菌門、接合菌門、壺菌門等是西藏地區(qū)的優(yōu)勢真菌類群。MAESTRE等[15]和REN等[16]研究結(jié)果表明，土壤真菌群落的優(yōu)勢門類主要為子囊菌門和擔子菌門。本試驗結(jié)果與上述研究較為一致。同時，針對藏北那曲草原[5]、青海果洛“三江源”高山草甸[17]、美國科羅拉多州高山苔原[18]等高寒草原生態(tài)系統(tǒng)的真菌多樣性研究結(jié)果與本試驗也較為一致，表明拉薩地區(qū)青稞種植農(nóng)田土壤真菌群落組成與高寒草原等其他生態(tài)系統(tǒng)具有較大的相似性。但本試驗結(jié)果與趙墾田等[7]的研究差異較大，說明采用分子生物學(xué)手段與可培養(yǎng)手段能夠?qū)ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)的研究結(jié)果造成較大差異[19-24]，不同的植被環(huán)境類型也會影響土壤微生物群落的組成。