樊祖清，蘆阿虔，王海濤，王 巖，段宏群，李紅麗，邱 光

(1.鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2.中國煙草總公司河南省公司，河南 鄭州 450000；3.河南省洛陽市煙草公司，河南 洛陽 471000; 4.江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210014)

煙草黑脛病和根結(jié)線蟲病的防控是煙葉生產(chǎn)中面臨的重要難題[1]。據(jù)統(tǒng)計，每年因各種土傳病害所導(dǎo)致的煙草總產(chǎn)值損失高達百億[2]。研究表明，煙葉線蟲病害與細菌、真菌及其他病毒病害等具有顯著的協(xié)同或聯(lián)合侵染機制[3-4]。土傳病害發(fā)生的原因很多，但其根源是由于長期施用化肥、農(nóng)藥造成土壤板結(jié)、土壤肥力嚴重下降，最終導(dǎo)致土壤微生態(tài)失衡、微生物群落結(jié)構(gòu)改變、病原菌數(shù)量增多，進而加劇了土傳病害的發(fā)生[5-7]。生物防治是指采用天然存在的拮抗微生物抑制作物病原菌繁殖，降低土傳病害發(fā)生的一項綠色、生態(tài)、高效新技術(shù)，已成為當(dāng)前國內(nèi)外農(nóng)業(yè)病蟲害綠色防控研究熱點之一[8-9]。

解淀粉芽孢桿菌B1619是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所研發(fā)的一種新型生防菌，由江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司將其開發(fā)為一種顆粒狀的生物菌劑，有效菌含量達到108cfu/g以上[10]。解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑對多種土傳病害如枯萎病、青枯病、根腐病和根結(jié)線蟲病等具有較好的防控效果，可用于多種作物，從而達到修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境的目的[11]。蔣盼盼[12]、楊曉云等[13]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌B1619對番茄、黃瓜等蔬菜作物的根結(jié)線蟲病防治效果顯著，作物增產(chǎn)明顯；張斌[14]和向亞萍等[15]在研究中指出，施用解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑可以有效防控番茄枯萎病。這些研究的共同之處是，施用解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑可以改變作物根際土壤微生物的種類和數(shù)量，進而降低土傳病害的發(fā)生，并促進作物增產(chǎn)。土壤中微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)與土壤健康水平息息相關(guān)，有益微生物的減少、病原微生物的增加會明顯提高作物的發(fā)病程度[16]，而添加有益微生物菌劑則可明顯緩解此類狀況發(fā)生。解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑在瓜果蔬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究已有報道，而對烤煙生長及煙田微生物的影響尚未見報道。鑒于此，向煙田中施用解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑，考察了煙株生長過程中根際土壤微生物區(qū)系的變化以及煙株農(nóng)藝性狀的變化，進而分析根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土傳病害發(fā)生間的聯(lián)系，為有效防治煙草土傳病害發(fā)生提供理論和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗田概況與供試材料

試驗選擇在河南省宜陽縣黑脛病和根結(jié)線蟲病多發(fā)的煙區(qū)進行，具體地點為鹽鎮(zhèn)鄉(xiāng)謝村，供試地塊連續(xù)3 a植煙，土壤種類為紅黏土，pH值為7.0，有機質(zhì)含量為22.98 g/kg，全氮含量為1.21 g/kg，堿解氮含量為67.5 mg/kg，有效磷含量為30.8 mg/kg，速效鉀含量為163.6 mg/kg。供試解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑(顆粒狀，有效菌含量達108cfu/g以上)由江蘇省蘇科農(nóng)化有限責(zé)任公司生產(chǎn)。供試煙葉品種為豫煙6號。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置2個處理，即處理(T)和對照(C)。C按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥進行。T在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上再施用2次B1619生物菌劑，具體方法：第1次在煙草移栽時穴施，施用量為120 kg/hm2；第2次在團棵期澆施，施用量為 60 kg/hm2。

1.3 樣品采集、測定項目及方法

1.3.1 樣品采集 在煙草移栽前、團棵期、旺長期和成熟期分別采集煙株根際土樣，按“S”法進行五點取樣。土樣樣品預(yù)處理：一部分置于4 ℃下冷藏，用于檢測室內(nèi)可培養(yǎng)微生物；另一部分裝離心管后冷凍寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因測序。

1.3.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量 土壤中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量采用涂布平板法測定[17]。細菌數(shù)量測定采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌數(shù)量測定采用孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌數(shù)量測定采用高氏一號培養(yǎng)基。

1.3.3 宏基因組微生物測序 采用宏基因組微生物分類測序測定土壤樣品中細菌和真菌微生物，由于放線菌門隸屬于細菌界，故宏基因組不單獨測定放線菌門。測序結(jié)果采用Alpha多樣性、細菌(真菌)群落結(jié)構(gòu)及其差異性表示[18]。

1.3.4 煙株農(nóng)藝性狀和發(fā)病率 在團棵期和旺長期測定煙株有效葉數(shù)、株高、莖圍和腰葉大小，成熟期計算產(chǎn)量、產(chǎn)值并測定烤煙黑脛病和根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況，收獲后檢測烤后煙葉化學(xué)成分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 17軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株根際可培養(yǎng)土壤微生物數(shù)量的影響

如表1所示，處理T和對照C煙株根際土壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量隨著煙株生長呈先增加后減少的趨勢，細菌和放線菌數(shù)量在團棵期達到最大，而真菌數(shù)量在旺長期達到最大。這可能是由于團棵期煙株根系分泌物多且適宜于細菌和放線菌的生長，旺長期根系分泌物可能更適宜于真菌生長。

在煙株生長的各個時期，處理T室內(nèi)可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量均低于對照C，這可能是由于施用解淀粉芽孢桿菌B1619改變了土壤根際微生物的種類和結(jié)構(gòu)比例，并抑制了部分細菌和放線菌的生長。團棵期，處理T與對照C的細菌、放線菌數(shù)量均差異顯著；旺長期和成熟期，處理T真菌數(shù)量分別較對照C增加27.8%、48.1%，且旺長期差異顯著，說明施用解淀粉芽孢桿菌對煙株根際土壤室內(nèi)可培養(yǎng)真菌微生物的數(shù)量有明顯影響。可見，施用解淀粉芽孢桿菌明顯改變了煙株根際土壤微生態(tài)環(huán)境。

表1 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Tab.1 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on the number of cultivatable microorganisms in rhizosphere soil of tobacco plants

注：不同小寫字母表示同種微生物同一處理不同生育時期差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同種微生物同一時期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicated that the same microorganism had significant difference in different growth stages under the same treatment(P<0.05)， different uppercase letters indicated significant difference of the same microorganism between different treatments at the same period(P<0.05).

2.2 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性也被稱為生境內(nèi)物種多樣性，主要關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目。利用Alpha多樣性分析中的OTU值、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、Coverage指數(shù)可對煙田根際土壤中微生物多樣性進行判斷。其中，OTU值表示將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，然后將相似度高于97%的序列分成同一個種類的操作分類單元，故OTU值的大小可表示樣本中物種數(shù)量的多少；Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物多樣性，數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)用于估計土壤微生物物種總數(shù)；Coverage指數(shù)表示各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，樣本中序列未被檢出的概率越低，該指數(shù)實際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況[18]。

處理T與對照C煙田根際土壤微生物Alpha多樣性測定結(jié)果如表2所示。煙草生長過程測定的Coverage指數(shù)均≥0.95，表明該數(shù)據(jù)可代表樣本的真實情況。處理T與對照C煙田根際土壤細菌OTU值隨煙草生育時期推進而逐漸降低，表明煙株生長過程中根際土壤細菌的多樣性逐漸降低；真菌OTU值隨煙草生育時期推進也基本呈逐漸降低趨勢，僅處理T真菌OTU值在團棵期有所增長，這可能是由于團棵期追施解淀粉芽孢桿菌B1619后根際土壤細菌多樣性改變，進而導(dǎo)致真菌OTU值發(fā)生變化。煙草團棵期，處理T細菌OTU值低于對照C，旺長期和成熟期表現(xiàn)則與團棵期相反；團棵期和旺長期處理T真菌OTU值高于對照C，成熟期則低于對照C。Chao1指數(shù)的變化與OTU值變化的趨勢一樣。處理T與對照C細菌Shannon指數(shù)在旺長期達到最大值，表明在旺長期根際土壤細菌微生物活躍，細菌多樣性最大。處理T真菌Shannon指數(shù)在團棵期達到最大值，這期間煙田施用了生物菌劑，影響了土著微生物群落結(jié)構(gòu)，可能是導(dǎo)致真菌多樣性出現(xiàn)變化的原因之一；對照C真菌Shannon指數(shù)在成熟期達到了最大值，這一時期是煙葉土傳病害暴發(fā)的時期，真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性也有所增加。

表2 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株根際土壤Alpha多樣性的影響Tab.2 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on Alpha diversity in rhizosphere soil of tobacco plants

2.2.2 群落結(jié)構(gòu)變化 宏基因組微生物分類測序結(jié)果統(tǒng)計表明，煙草生長各個時期根際土壤微生物的數(shù)目如表3所示。由表3可知，土壤根際細菌和真菌在屬水平上種類數(shù)量隨著煙株的生長而減少。其中，團棵期處理T與對照C細菌屬數(shù)量相差7種，旺長期對照C細菌屬數(shù)量比處理T多34種，成熟期處理T細菌屬數(shù)量比對照C多29種；團棵期、旺長期處理T真菌屬數(shù)量比對照C分別多22、37種，成熟期則表現(xiàn)為處理T比對照C少30種。在目水平和門水平上，細菌和真菌微生物種類變化較小。在煙株整個生長過程中，細菌在目、門水平上分別最多有11、4種差異變化；真菌在目、門水平上分別最多有8、1種變化?？梢姡┯媒獾矸垩挎邨U菌對根際土壤屬水平微生物的種類數(shù)影響較大。

表3 施用解淀粉芽孢桿菌后煙株根際土壤微生物在屬、目、門水平上的數(shù)量變化Tab.3 Microbial quantity changes in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus,order and phylum level after application of Bacillus amyloliquefaciens

屬水平細菌、真菌分布頻率超過1%的微生物分別如表4、表5所示，將菌種分布頻率超過5%的定義為優(yōu)勢菌屬。由表4可知，煙株移栽前的細菌優(yōu)勢菌屬有4種,即Exiguobacterium、Citrobacter、Gp6、Acinetobacter。團棵期處理T的細菌優(yōu)勢菌屬與移栽前相同；對照C優(yōu)勢菌屬較處理T少了Acinetobacter，多了Gp4。旺長期處理T優(yōu)勢菌屬有4種，即Gp6、Gemmatimonas、Exiguobacterium、Sphingomonas。成熟期處理T優(yōu)勢菌屬有6種，即Sphingomonas、Exiguobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Gp4、Citrobacter。旺長期和成熟期處理T與對照C的優(yōu)勢菌屬組成相同，但分布頻率不同。Sphingomonas是降解土壤有毒物質(zhì)最有效的微生物菌屬之一，還具有促進煙株吸收營養(yǎng)和抵抗多種病原菌侵擾的作用，該菌屬中某些菌株具有固氮和脫氫的特性，在維系土壤氮平衡方面有著重要作用[19]。Sphingomonas在移栽前和團棵期不屬于優(yōu)勢菌屬，但在旺長期和成熟期其分布頻率上升并成為優(yōu)勢菌屬，且處理T比對照C分別高6.98%和15.53%，說明隨著煙株的生長，煙株吸收根際土壤營養(yǎng)、釋放根際分泌物，Sphingomonas類微生物大量生長繁殖，也說明解淀粉芽孢桿菌B1619在煙株生長過程中對有益微生物的生長繁衍起到了促進作用。

表4 施用解淀粉芽孢桿菌后煙株根際土壤細菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分布Tab.4 Distribution of bacterial community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefacien %

注：3、6、11、15、18號細菌為當(dāng)前國際上已發(fā)現(xiàn)但尚未命名的菌種，僅以代號稱之；9、10、14、17、19、21號細菌為尚未確定中文名稱的菌種。

Note:Numbers 3,6,11,15 and 18 were currently found in the world but not yet named,and they were designated by code only.Numbers 9,10,14,17,19 and 21 were strains whose Chinese name had not been determined.

由表5可知，煙株移栽前的真菌優(yōu)勢菌屬有5種，即Pseudogymnoascus、Absidia、Setomelanomma、Pleospora、Cryptococcus。團棵期，處理T真菌優(yōu)勢菌屬有6種，即Malassezia、Cryptococcus、Aspergillus、Gibberella、Thielavia、Geosmithia；對照C比處理T少了Malassezia、Aspergillus、Geosmithia，多了Pseudogymnoascus、Pleospora、Cystofilobasidium、Absidia。旺長期，處理T的真菌優(yōu)勢菌屬有4種，即Gibberella、Aspergillus、Thielavia、Cystofilobasidium；對照C優(yōu)勢菌屬僅有Aspergillus1種，處理T比對照C多了3種優(yōu)勢菌屬。成熟期，處理T真菌優(yōu)勢菌屬有5種，即Pulchromyces、Candida、Pleospora、Spizellomyces、Absidia；對照C優(yōu)勢菌屬有3種，即Absidia、Inonotus、Ashbya；處理T與對照C僅有Absidia一種共同優(yōu)勢菌屬。Gibberella可以分泌赤霉素，其突出的生理作用是促進植物莖的伸長，引起植株快速生長。團棵期處理TGibberella分布頻率低于對照C，此時煙株的生長差異不明顯；旺長期處理TGibberella分布頻率比對照C高 1 058.60%，可能導(dǎo)致煙株生長發(fā)育加速。

表5 施用解淀粉芽孢桿菌后煙株根際土壤真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分布Tab.5 Distribution of fungal community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefaciens %

續(xù)表5 施用解淀粉芽孢桿菌后煙株根際土壤真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分布Tab.5(Continued) Distribution of fungal community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at the genus levelafter application of Bacillus amyloliquefaciens %

注：編號3、7、11、16、18、19、24、26為尚未確定中文名稱的菌種。

Note: Numbers 3,7,11,16,18,19,24 and 26 were strains whose Chinese name had not been determined.

2.2.3 群落結(jié)構(gòu)差異性分析 試驗田根際土壤微生物OTU值水平上的群落聚類樹狀圖如圖1所示。從圖1A可以看出，在煙株生長的各個時期，處理T與對照C煙株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)相似；移栽前與團棵期聚為一類，旺長期與成熟期聚為一類，二類之間差異較大，說明煙株生長后期，煙株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)改變較大。從圖1B可以看出，成熟期處理T與對照C根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似，移栽前的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與成熟期聚為一類；團棵期處理T、對照C與旺長期處理T煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)相似，旺長期對照C煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)單獨聚為一類，說明隨著煙株的生長，其根際土壤真菌微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，在旺長期變化最為明顯?？梢?，施用解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑可以改變煙株生長過程中根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，且對煙株根際土壤真菌的影響更大。

A. 細菌； B.真菌A.Bacteria; B.Fungi圖1 煙株根際土壤微生物OTU值水平上的群落聚類分析Fig.1 Cluster analysis of microbial community at OTU value level in rhizosphere soil of tobacco plants

2.3 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株農(nóng)藝性狀的影響

由表6可知，團棵期和旺長期，處理T與對照C煙株的株高均差異顯著，團棵期表現(xiàn)為對照C高于處理T，旺長期則相反；團棵期和旺長期，處理T煙株的有效葉數(shù)、莖圍和腰葉大小均優(yōu)于對照C，但差異均不顯著。

表6 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株農(nóng)藝性狀的影響Tab.6 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on agronomic traits of tobacco plants

注:同列不同小寫字母表示同時期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column showed significant differences between different treatments in the same period (P<0.05).

由于試驗?zāi)甓葻熤晟L前期干旱、后期降雨較多，故烤后煙葉產(chǎn)量比往年低。 由表7可見， 處理T煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值均顯著高于對照C，分別較對照C增加41.67%和77.69%。

表7 施用解淀粉芽孢桿菌對烤后煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響Tab.7 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on yield and output value of roasted tobacco leaves

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant differences (P<0.05).

如表8所示，處理T烤后煙葉化學(xué)成分與對照C沒有顯著差異，表明施用解淀粉芽孢桿菌B1619對烤后煙葉化學(xué)品質(zhì)的影響較小。

2.4 施用解淀粉芽孢桿菌對煙株病害發(fā)生的影響

從表9可以看出，處理T與對照C煙株根結(jié)線蟲病發(fā)病率差異不大，處理T黑脛病發(fā)病率顯著高于處理C，這與預(yù)期相反。

表8 施用解淀粉芽孢桿菌對烤后煙葉化學(xué)成分含量的影響 Tab.8 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on chemical constituents of roasted tobacco leaves %

表9 施用解淀粉芽孢桿菌對烤煙發(fā)病率的影響Tab.9 Effect of application of Bacillus amyloliquefaciens on the disease incidence of flue-cured tobacco %

3 結(jié)論與討論

微生物作為土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的參與者之一，在有機質(zhì)礦化、腐殖質(zhì)形成和分解、植物營養(yǎng)轉(zhuǎn)化等過程中起著不可替代的作用[20]。生物菌劑具有普通微生物效應(yīng)的同時，還可以抑制病原菌的活性。近年來，利用生物菌劑防治土傳病害越來越多地受到人們的重視，但是由于土壤條件的復(fù)雜性，生防效果明顯和穩(wěn)定的應(yīng)用實例并不多見[21]。通常情況下，施用生物菌劑后有益微生物在土壤中迅速繁殖，通過分解土壤中的礦物質(zhì)、增加土壤中的抗菌物質(zhì)和增強碳源利用強度，在一定程度上與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)而使病原菌無法大量繁殖，從而對土傳病害起到一定的抑制作用[22]。本試驗結(jié)果表明，室內(nèi)可培養(yǎng)微生物數(shù)量隨著煙株的生長先增加后減少，細菌和放線菌數(shù)量在團棵期達到最大，真菌數(shù)量在旺長期達到最大。在煙株生長的各個時期，室內(nèi)可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量均表現(xiàn)為施用解淀粉芽孢桿菌處理少于對照；團棵期施用解淀粉芽孢桿菌處理真菌數(shù)量少于對照，旺長期和成熟期則與之相反。解淀粉芽孢桿菌B1619的施用，改變了煙株根際土壤微生物屬水平上的生態(tài)平衡，對根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量產(chǎn)生了影響，而對根際土壤目、門水平上的微生物種類影響較小。進一步分析表明，Sphingomonas在旺長期和成熟期屬于優(yōu)勢益生菌屬，且施用解淀粉芽孢桿菌處理比對照分別高6.98%和15.53%；團棵期施用解淀粉芽孢桿菌處理的Gibberella分布頻率少于對照，而旺長期處理T比對照C高 1 058.60%，這與煙株生長的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)一致。烤后煙葉化學(xué)成分和產(chǎn)量、產(chǎn)值顯示，施用解淀粉芽孢桿菌B1619對煙葉化學(xué)品質(zhì)并沒有產(chǎn)生明顯影響，但使烤后煙葉產(chǎn)量顯著提高41.67%，產(chǎn)值顯著提高77.69%。研究表明，生物菌劑對作物病害防治的效果和穩(wěn)定性受多種因素影響[23]。通常情況下，由生防菌生產(chǎn)的生物菌劑在多年、連續(xù)施用條件下，施入的有益微生物才可能定殖并大量繁殖，之后才可能對土壤微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著而穩(wěn)定的影響，因此，利用生物菌劑防治土傳病害的大田效果需要多年的田間應(yīng)用和驗證。本試驗施用解淀粉芽孢桿菌B1619生物菌劑對煙草黑脛病和根結(jié)線蟲病的防病效果并未達到預(yù)期目標(biāo)，多年連續(xù)施用的生防效果是否明顯尚待進一步試驗。