霍冬敖，杜旭燁，朱 斌，楊 凡，郭 娟

(1.貴州師范大學(xué)，貴州 貴陽 550001； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

小麥儲(chǔ)藏蛋白主要由谷蛋白和醇溶蛋白組成，谷蛋白是一種多聚體蛋白，由谷蛋白亞基通過二硫鍵相互交聯(lián)形成。 谷蛋白亞基根據(jù)分子質(zhì)量分為高分子質(zhì)量谷蛋白亞基和低分子質(zhì)量谷蛋白亞基[1]。醇溶蛋白是一種單體蛋白，主要包括α-、γ-、ω-醇溶蛋白3類，它們可以很好地溶解在70%乙醇中[2]。在六倍體小麥中，α-醇溶蛋白由第6同源群染色體短臂上的Gli-2位點(diǎn)編碼，γ-和ω-醇溶蛋白由第1同源群染色體短臂上與Glu-3位點(diǎn)連鎖的Gli-1位點(diǎn)編碼[1]。在這3類醇溶蛋白中，ω-醇溶蛋白含量最低，因此，在研究中常常被忽略。前人根據(jù)ω-醇溶蛋白N端序列差異，將其分為ARE、ARQ、KEL、SRL型4類[3]。其中，ARE、ARQ和KEL型ω-醇溶蛋白基因位于1A和1D染色體上，又稱為ω-1和ω-2醇溶蛋白，SRL型ω-醇溶蛋白又稱為ω-5醇溶蛋白，其編碼基因位于1B染色體上[4]。DU等[5]研究發(fā)現(xiàn)了一系列新的ω-醇溶蛋白類型，包括GRL、NRL、SRP、SRQ、SRM型ω-醇溶蛋白。另外，根據(jù)ω-醇溶蛋白在凝膠電泳中的遷移率，可將其分為fast ω-醇溶蛋白和slow ω-醇溶蛋白，前者即ω-5醇溶蛋白，后者主要為ω-1和ω-2醇溶蛋白[4]。

小麥儲(chǔ)藏蛋白是保證人類蛋白質(zhì)的重要來源之一，但也是造成小麥過敏癥的重要過敏原。小麥依賴-運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)(Wheat-dependent,exercise-induced anaphylaxis,WDEIA)是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的一種多因子罕見疾病，患者在進(jìn)食小麥制品后，一旦運(yùn)動(dòng)就會(huì)出現(xiàn)蕁麻疹、紅腫、全身瘙癢、低血壓甚至過敏性休克等癥狀[6]。研究發(fā)現(xiàn)，fast ω-醇溶蛋白是誘發(fā)該疾病的主要過敏原，但是其發(fā)病機(jī)制尚不明確[7]。fast ω-醇溶蛋白中主要的IgE結(jié)合抗原表位包括QQFHQQQ、QQPPQQ、QQIPQQQ、QQLPQQQ、QQFPQQQ、QQSPEQQ、QQSPQQQ、QQYPQQQ、PYPP，其中，QQIPQQQ是主要的IgE結(jié)合抗原表位[8-10]。DU等[5，11]通過分析小麥及其近緣植物中的fast ω-醇溶蛋白序列發(fā)現(xiàn)，多肽QQFPQQQ在fast ω-醇溶蛋白中所占比例最大，而QQIPQQQ所占比例較低。偏凸山羊草(Aegilopsventricosa，DvDvMvMv，2n=4X=28)是小麥重要的近緣植物，含有大量的優(yōu)異基因，可用于小麥的遺傳改良。目前，僅有部分fast ω-醇溶蛋白基因從小麥及其近緣植物中被克隆出來，包括小麥(Triticumaestivum)、一粒小麥(Triticummonococcum)、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、西爾斯山羊草(Aegilopssearsii)、擬斯貝爾脫山羊草(Aegilopsspeltoides)[5,11]。但是，對偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白基因的研究尚未見報(bào)道。為此，克隆偏凸山羊草中的fast ω-醇溶蛋白基因，并對其序列和IgE結(jié)合抗原表位進(jìn)行分析，以期了解IgE結(jié)合抗原表位在Dv和Mv基因組中的分布，并為制備單克隆抗體進(jìn)行IgE結(jié)合抗原表位的定量分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

偏凸山羊草Y311來自國家種質(zhì)資源庫，目前保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

取開花后20 d的偏凸山羊草Y311籽粒，液氮速凍后，用研缽迅速研磨粉碎，利用植物RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取總RNA，利用HiFi Script cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 基因克隆及測序

合成引物P1和P2，用于擴(kuò)增fast ω-醇溶蛋白基因，P1:5′-GAGCAATAGTAAACACAAATCAAAC-3′，P2:5′-GTTAGTCAATGGAGCATAATGTAACG-3′。為保證試驗(yàn)的可靠性，本研究使用高保真LATaq酶和2 × GC Buffer Ⅰ(TaKaRa)。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括cDNA 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，2 × GC Buffer Ⅰ 25 μL，dNTPs(0.5 mmol/L) 2 μL，LATaq1 μL，其余均為滅菌蒸餾水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收純化后連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌落PCR鑒定，篩選陽性菌落，送至華大基因公司進(jìn)行基因測序。

1.4 序列分析

利用DNAMAN 6.0.2軟件對本研究克隆的fast ω-醇溶蛋白基因與NCBI中已發(fā)表的典型ω-醇溶蛋白基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并利用MEGA 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹[12-13]。IgE結(jié)合抗原表位的分析和統(tǒng)計(jì)參照BATTAIS等[8]和MATSUO等[9]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白基因克隆及序列分析

由圖1可知，利用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增共獲得2條明顯的條帶，分別為700 bp和1 200 bp。對篩選到的陽性克隆進(jìn)行測序，通過序列比對、分析，最終獲得了8個(gè)fast ω-醇溶蛋白基因，并將所得的基因序列提交到GenBank中，所獲得的基因編號(hào)為KY368672—KY368679。這8個(gè)基因全長分別為468 bp、414 bp、285 bp、1 020 bp、399 bp、1 023 bp、396 bp、489 bp?；蚪M擴(kuò)增結(jié)果只顯示2條主帶，而測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了低分子質(zhì)量的基因，這可能是由于fast ω-醇溶蛋白基因中重復(fù)序列相對規(guī)則且較長，容易產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)相互纏繞，造成其在瓊脂糖凝膠電泳中無法分離。氨基酸序列多重比對表明，這8個(gè)fast ω-醇溶蛋白具有典型的ω-醇溶蛋白結(jié)構(gòu)，包括1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)N末端、1個(gè)重復(fù)區(qū)和1個(gè)C末端(圖2)。根據(jù)ω-醇溶蛋白N端前3個(gè)氨基酸序列差異對ω-醇溶蛋白進(jìn)行分類[4]，

這8個(gè)ω-醇溶蛋白包括1個(gè)SRQ型ω-醇溶蛋白(KY368672)、2個(gè)TRQ型ω-醇溶蛋白(KY368673、KY368674)和5個(gè)SRL型ω-醇溶蛋白(KY368675—KY368679)(表1)。值得注意的是，本研究所得到的全部SRL型ω-醇溶蛋白中都含有1個(gè)多聚谷氨酰胺區(qū)，而以前報(bào)道的SRL型ω-醇溶蛋白中無此類結(jié)構(gòu)。

M：DNA Marker Ⅰ;1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

方框標(biāo)注的序列為多聚谷氨酰胺區(qū)

基因編號(hào)GenBank No.基因組Genome類型Type基因長度/bpLength of the gene 氨基酸數(shù)/個(gè)Amino acids number分子質(zhì)量/kuMolecular weightKY368672DvSRQ46815516.55KY368673DvTRQ41413714.06KY368674DvTRQ285948.90KY368675MvSRL1 02033938.97KY368676MvSRL39913213.39KY368677MvSRL1 02334039.03KY368678MvSRL39613113.21KY368679MvSRL48916217.03

2.2 偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白IgE結(jié)合抗原表位分析

通過分析已知的IgE結(jié)合抗原表位(表2)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白中均有多肽QQFPQQQ，在KY36875和KY36877中出現(xiàn)次數(shù)最多，分別為18次和17次。同時(shí)，這2個(gè)fast ω-醇溶蛋白中都含有21個(gè)IgE結(jié)合抗原表位，意味著它們可能有較強(qiáng)的致敏能力。前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥中4個(gè)主要的IgE結(jié)合抗原表位為QQIPQQQ、QQFPQQQ、QQSPQQQ和QQSPEQQ[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，QQFPQQQ出現(xiàn)的頻率最高。因此，未來可以該多肽為參考序列，制備單克隆抗體，為IgE結(jié)合抗原表位的定量奠定基礎(chǔ)。

表2 偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白IgE結(jié)合抗原表位分析Tab.2 Analysis of IgE-binding epitopes of fast ω-gliadins in Aegilops ventricosa 個(gè)

2.3 偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白進(jìn)化分析

對偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析(圖3)表明，系統(tǒng)發(fā)生樹被分為2個(gè)分支。由Mv和Dv基因組編碼的fast ω-醇溶蛋白分處2個(gè)分支上，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Mv基因組編碼的fast ω-醇溶蛋白與S基因組編碼的fast ω-醇溶蛋白(KR077907和KR077908)聚在一起，說明這2個(gè)基因組具有更近的親緣關(guān)系。Mv基因組編碼的fast ω-醇溶蛋白中有多聚谷氨酰胺序列，而之前該結(jié)構(gòu)僅在α-醇溶蛋白中出現(xiàn)，說明fast ω-醇溶蛋白在進(jìn)化中可能和α-醇溶蛋白具有相似的進(jìn)化歷程。

圖3 偏凸山羊草fast ω-醇溶蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of fast ω-gliadins cloned from Aegilops ventricosa

3 結(jié)論與討論

WDEIA是小麥面粉誘發(fā)的嚴(yán)重速發(fā)性食物過敏，雖然發(fā)病率較低，但會(huì)造成嚴(yán)重的后果，甚至休克。前人研究發(fā)現(xiàn)，小麥fast ω-醇溶蛋白是誘發(fā)WDEIA的主要過敏原，其主要的IgE結(jié)合抗原決定簇也被揭示，但是WDEIA的發(fā)病原因尚不清楚[6,8-9]。本研究以小麥近緣植物偏凸山羊草為材料，克隆了其fast ω-醇溶蛋白基因，并分析了其IgE結(jié)合抗原決定簇?cái)?shù)量，為下一步抗體制備及IgE結(jié)合抗原決定簇定量分析奠定了基礎(chǔ)。

由于小麥儲(chǔ)藏蛋白在信號(hào)肽、N端和C端的序列保守，以DNA為模板，利用同源克隆技術(shù)是獲得小麥儲(chǔ)藏蛋白基因的有效途徑[14-15]。在前期工作中，嘗試?yán)没蚪MDNA作模板克隆fast ω-醇溶蛋白基因，始終未獲成功，而利用灌漿期籽粒的cDNA作模板，則能夠成功克隆。另外，雖然PCR產(chǎn)物表明，主要的目的片段在750 bp和1 200 bp附近，由于瓊脂糖凝膠分辨率有限，分子質(zhì)量相近的基因在凝膠中顯示為同一條帶，通過測序，共獲得8個(gè)fast ω-醇溶蛋白基因。測序結(jié)果出現(xiàn)較多的小分子質(zhì)量的基因，這可能由于fast ω-醇溶蛋白重復(fù)區(qū)較長，PCR產(chǎn)物中存在超螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小分子質(zhì)量基因與大分子質(zhì)量基因相互纏繞，以致在瓊脂糖凝膠電泳中無法分開[5]。與α-和γ-醇溶蛋白相比，ω-醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)較為簡單，只包括信號(hào)肽、N端、重復(fù)區(qū)和C端，而fast ω-醇溶蛋白和slow ω-醇溶蛋白在重復(fù)區(qū)的結(jié)構(gòu)差異較大，主要表現(xiàn)為重復(fù)元件的差異[5]。本研究獲得的由Mv基因組編碼的fast ω-醇溶蛋白存在一個(gè)類似于α-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺序列，這表明該類fast ω-醇溶蛋白和α-醇溶蛋白在進(jìn)化上可能有相同的祖先或者相似的進(jìn)化路徑。

減少小麥中IgE結(jié)合抗原決定簇是降低WDEIA發(fā)病程度的重要途徑。ALTENBACH等[16]利用RNAi技術(shù)降低了小麥中ω-5醇溶蛋白IgE結(jié)合抗原決定簇的數(shù)量，創(chuàng)制了低致敏性的小麥材料。WAGA等[17]發(fā)現(xiàn)了1株ω-醇溶蛋白基因沉默的天然變異小麥植株，臨床研究表明，其致敏程度能夠降低70%。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，基因編輯已經(jīng)在小麥基因沉默上得到了廣泛應(yīng)用，SNCHEZ-LEN等[18]利用基因編輯沉默了小麥及硬粒小麥的α-醇溶蛋白基因，其面粉已經(jīng)在食品加工中得到了應(yīng)用。在育種方面，對IgE結(jié)合抗原決定簇進(jìn)行定量是評價(jià)小麥致敏能力的重要途徑，目前，α-醇溶蛋白的特異性抗體已經(jīng)被合成并得到了廣泛的利用，而fast ω-醇溶蛋白的特異性單克隆抗體尚未見報(bào)道。本研究中，QQFPQQQ出現(xiàn)頻率最高，該多肽可作為抗原用于單克隆抗體的制備，從而用于小麥致敏能力的評價(jià)。