阮越勇，張浩軍，疏欣楊，王蓓蕾，張紓難，2?

（1.北京中醫(yī)藥大學 研究生院，北京 100029；2.國家呼吸疾病臨床研究中心，中日友好醫(yī)院 呼吸中心中醫(yī)肺病，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究所，北京 100029）

彌漫性間質(zhì)性肺疾?。↖LD）或稱肺纖維化，為最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病機制尚未完全清楚[1]。 之前觀點認為肺間質(zhì)細胞的激活和增殖，是由于進行性炎癥、炎癥細胞侵襲、細胞因子失衡誘導的[2]。近些年來，大量研究報道，尤其是特發(fā)性肺纖維化和間質(zhì)性肺炎，炎癥反應不一定是必要條件，而肺泡上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelialmesenchymat transition，EMT） 和信號傳導通路在誘導肺纖維化中的作用逐步獲得了認可[3，4]。 EMT是一種生物學現(xiàn)象，其中上皮細胞在某種病理生理條件下轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞。它由3 個類型組成，凡是涉及修復創(chuàng)傷、組織再生和器官功能障礙，歸類為2 型EMT，主要生物學功能是修復成纖維細胞和由于創(chuàng)傷和炎癥狀況引起的組織損傷[1，5，6]。雖然體內(nèi)實驗在肺、腎、肝臟等臟器纖維化進程中是否存在EMT 仍存在爭議，但體外研究中EMT 的發(fā)生已被證實[2]。 作為一種多功能生長因子，人轉(zhuǎn)化生長因子 （transforming growth factor-β1，TGFβ1）可在各種上皮細胞中誘導EMT，包括肺、肝、腎上皮細胞，被認為是器官纖維化的“總開關(guān)”[3]。EMT 涉及腫瘤侵襲和纖維化發(fā)生發(fā)展，已成為近年來的研究熱點，越來越引起國內(nèi)外相關(guān)學者的重視[7]。

本實驗通過TGF-β1 刺激A549 細胞，分析不同時間點，從細胞外形至基因蛋白的表達，探索是否存在時間的依賴性，從而進一步了解TGFβ1 誘導EMT 發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

A549 上皮細胞系，購自國家實驗細胞資源共享平臺。 F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購買自Gibco 公司；DMSO（dimethyl sulfoxide）購自Amresco 公司；MTT 購自Sigma 公司；TGF-β1 購自PeproTech 公司；E-Cadherin （E-Cad） 抗體、Fibronectin （FN）抗體、Vimentin （Vim）抗體購自proteintech 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Thermo scientific。 IX71熒光倒置相差顯微鏡購自日本Olympus 公司；CO2孵育箱、 酶標儀購自美國Thermo scientific 公司；7500 Real-Time PCR 儀購自Applied Biosystems公司；半干轉(zhuǎn)儀器購自Bio-Rad 公司；發(fā)光檢測儀購自Bio-Rad ChemiDoc 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

A549 細胞用F-12 培養(yǎng)基（ 含有100U/ml 青霉 素，100mg/L鏈霉素和10%胎牛血清） 于37℃，5% CO2條件下在孵育箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合至80%以上，以0.25% 胰蛋白酶消化，進行相關(guān)實驗。取6 孔培養(yǎng)板，每孔加入2.5ml 的5×104細胞，以無血清培養(yǎng)基饑餓15h。 將體外培養(yǎng)A549 細胞分隨機2 組：空白組、模型組?？瞻捉M為A549 細胞+F-12 培養(yǎng)基； 模型組為A549 細胞+F-12 培養(yǎng)基+10ng/ml TGF-β1。 繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。

1.2.2 MTT 實驗

將8×103個A549 細胞加到96 孔板，24h 后細胞貼壁，吸出培養(yǎng)液，加入5、10ng/ml 濃度的TGF-β1 為模型組，加入F-12 完全培養(yǎng)液為空白組，并在24h、48h、72h 繼續(xù)培養(yǎng)。 隨后加入10μl MTT，并在培養(yǎng)箱中孵育4h，再加入100μl 三聯(lián)溶解液放培養(yǎng)箱中孵育過夜。 在490nm 波長檢測吸光度。 空白孔的平均吸光度作為100%，模型孔的吸光度除以正?？椎钠骄舛?，乘以100%，得到每孔的增殖率。

1.2.3 細胞形態(tài)檢測

TGF-β1 經(jīng)過24h、48h、72h 誘導A549 細胞后，將細胞放置顯微鏡在60 倍條件下觀察。 每組隨機分成5 個樣本，每樣本隨機拍照5 個視野，其相片用在細胞形態(tài)對比。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR）

TGF-β1 干預24h、48h、72h 后，用Trizol 一步法提取總RNA。 測定RNA 水平，通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA 為模板加入靶基因（Fn，Vim，ECad），參照基因（β-actin）為反應體系的基礎(chǔ)，設定反應參數(shù)并擴增目標基因，樣品的Ct 值與樣品的第一版本的拷貝之間存在線性關(guān)系。其中以βactin，F(xiàn)n，Vim，E-Cad，外顯子序列為模板，Oligo 7.0 為設計模板。 引物序列如表1。

1.2.5 Western blot（蛋白印跡法）分析

TGF-β1 處理細胞24h、48h、72h 的A549 細胞。 細胞用適量的0.1%PMSF 裂解，20s 超聲破碎，冰上孵育30min。 高速離心后采集漂浮物質(zhì)并在BCA 模式下測量。 將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)至標準濃度后，取12～15μl 樣品用于SDS-PAGE 電泳，并將半干膜法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1h 后，加入一抗，稀釋比例為1：3000 并在4℃下孵育過夜。 IgG 抗兔二抗在37℃下孵育1h。 用PBST 沖洗10min×3 次，并使發(fā)光檢測儀曝光拍照。以β-actin 為內(nèi)參，用Quantity One 系統(tǒng)分析，并對凝膠條帶的信號強度進行E-Cad、FN、Vim半定量分析。

表1 引物序列

1.2.6 免疫熒光法

將細胞爬片放置孔底，將細胞種植到6 孔板，分別加入TGF-β1 刺激24h、48h、72h。 移入1 個干凈的六孔板冷PBS 浸泡<3min。 每個玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定15min。 用微量移液槍加一抗，稀釋比例1：100，4℃冰箱過夜。 PBS-Tween洗，3 次×5min。 用微量移液槍加入二抗，稀釋比例1：150，覆蓋均勻平放室溫孵育1h，避光。 PBSTween 洗3 次×5min，將6 孔板倒置顯微鏡在200倍條件下觀察每孔細胞。每組隨機選取5 個樣本、每個樣本隨機選取5 個視野拍照。 應用Image J軟件處理圖片。

1.3 統(tǒng)計學方法

圖1 TGF-β1 刺激不同時間對A549 細胞增殖的影響

使用Prism5.0 軟件分析組間差異，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t 檢驗，然后應用Tukey 法。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 對A549 細胞增殖的影響

通過MTT 法在5ng/ml 和10ng/ml 濃度和24h、48h、72h 條件點下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48h、72h 與空白組比較，在5ng/ml TGF-β1 細胞有增殖作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在10ng/ml TGF-β1 細胞有明顯增殖作用，差異有統(tǒng)計學意義 （均P<0.01），見圖1。

2.2 TGF-β1 刺激在不同時間細胞形態(tài)的變化

據(jù)MTT 實驗結(jié)果，選10ng/ml 作為TGF-β1的刺激濃度。 將細胞放置倒置顯微鏡下，圖2（見封二）示，在24h 與空白組比較，模型組無明顯變化。在48h 與空白組比較，模型組細胞有形態(tài)學改變，部分細胞從類似于橢圓形變?yōu)轭愃粕扉L的紡錘樣的形狀，細胞圓形度明顯下降。在72h 與空白組比較，模型組細胞有明顯形態(tài)學改變，幾乎所有細胞呈伸長的紡錘形態(tài)，細胞圓形度極度降低。

圖2 TGF-β1刺激不同時間對A549細胞形態(tài)的影響（×50）

72h時與空白組比較，模型組細胞有明顯形態(tài)學改變，幾乎所有細胞呈伸長的紡錘樣的形態(tài)，細胞圓形度極度降低。

2.3 TGF-β1 誘導EMT 在不同時間點FN、Vim、E-Cad mRNA 表達水平

通過q-PCR 檢測，圖3 示，在48h 與空白組比較，模型組FN mRNA 表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），E-Cad mRNA 表達明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 在72h 與空白組比較，模型組FN mRNA 表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），E-Cad mRNA 表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.4 TGF-β1 誘導EMT 在不同時間點FN、Vim、E-Cad 熒光表達水平

圖3 FN、Vim、E-Cad mRNA 表達水平

通過免疫熒光法，結(jié)果顯示在48h、72h 與空白組比較，模型組FN、Vim 熒光表達上調(diào)，E-Cad熒光表達下調(diào)（圖4，見封二）。

圖4 FN、Vim、E-Cad 熒光表達水平（×200）

免疫熒光法顯示，在48h、72h時與空白組比較，模型組FN、Vim 熒光表達上調(diào)，E-Cad 熒光表達下調(diào)。

2.5 TGF-β1 誘導EMT 在不同時間點FN、Vim、E-Cad 蛋白表達水平

通過Western blot 檢測，結(jié)果顯示在48h 與空白組比較，模型組FN 蛋白表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），E-Cad 蛋白表達明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 在72h 與空白組比較，模型組FN、Vim 蛋白表達明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），E-Cad 蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖5）。

圖5 FN、Vim、E-Cad 蛋白表達水平

3 討論

EMT 是參與胚胎發(fā)育及許多慢性疾病和纖維化及腫瘤疾病發(fā)展有關(guān)的一種現(xiàn)象。 EMT 的過程，也稱為“轉(zhuǎn)分化”。 此現(xiàn)象中，細胞失去上皮特性，包括極化和與特定細胞的間接處，獲得遷移的能力，允許它們離開上皮層并融入周圍組織[8～10]。EMT 是指上皮細胞通過其間充質(zhì)特性極化的細胞和分子轉(zhuǎn)換。大量研究表明，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達與人類許多癌癥的不良預后和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。EMT 現(xiàn)象不但促進腫瘤細胞侵襲的作用以外，而且還顯示賦予腫瘤細胞對細胞凋亡和失去凋亡的抗性[11]。TGF-β1 為誘導EMT 發(fā)生的主要因子，大多數(shù)學者認為TGF-β1 誘導EMT 有兩個途徑，依賴Smad 信號通路和非依賴Smad 信號通路。正常情況下，細胞外基質(zhì)的TGF-β1 處于無活性狀態(tài)。在各種刺激因素作用下，TGF-β1 被激活形成二聚體，此二聚體與TGF-β2 型和TGF-β1 型受體相結(jié)合，形成異二聚體，使Smad2、Smad3 磷酸化，磷酸化的Smad2/3 與Smad4 形成復合體并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，激活轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug 等，致EMT 發(fā)生。 此外，TGF-β1 誘導的EMT 也能激活非Smad信號轉(zhuǎn)導途徑，包括MAPK、Akt 等通路。 TGF-β1與受體結(jié)合后激活MAPKK，然后MAPKK 激活MAPK，最終致EMT[12]。

本實驗為了證實在體外實驗TGF-β1 刺激時間越長，則EMT 現(xiàn)象發(fā)生越為明顯。 本研究將A549 細胞為模型，以TGF-β1 為刺激因子 誘導EMT 發(fā)生，并且使用當前的先進技術(shù)，從形態(tài)學和分子學角度，對EMT 發(fā)生的時間和信號通路進行研究。 首先，從細胞形態(tài)學結(jié)果來看，在48h、72h 與空白組比較，模型組大部分細胞呈紡錘樣的形狀，細胞的圓形度極度降低。 提示48h 和72h均為TGF-β1 促進細胞形態(tài)變化的時間，尤其72h 最為顯著。 根據(jù)上述的結(jié)果，以q-PCR、Western blot、免疫熒光技術(shù)，來觀察TGF-β1 對肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化不同時間點基因和蛋白的表達。 結(jié)果示在48h 和72h 時間點，F(xiàn)N mRNA、蛋白及熒光表達上調(diào)，E-Cad mRNA、蛋白及熒光表達下調(diào)。 說明在這2 個時間段TGF-β1 能夠降低上細胞標志物E-Cad，并增加間質(zhì)細胞標志物FN、Vim 的表達，從而誘導EMT 現(xiàn)象的發(fā)生。 但仔細觀察結(jié)合統(tǒng)計學，可以看出上皮細胞標志物ECad，在48h 和72h 時mRNA、蛋白均有同樣程度的下調(diào)。 而間質(zhì)細胞標志物FN 和Vim，在48h 和72h 時mRNA、 蛋白有不同程度的上調(diào)，尤其在72h FN 和Vim mRNA、 蛋白表達上調(diào)更為明顯。提示在早期時候肺泡上皮細胞先受損，晚期隨著上皮細胞的損傷，間質(zhì)細胞亦出現(xiàn)上升的趨勢，最終導致EMT 的發(fā)生。本研究的結(jié)果基本符合臨床上肺纖維化的臨床表現(xiàn)及影像學特征，以特發(fā)性肺纖維化（IPF）為例，初期患者主要表現(xiàn)為干咳少談或沒有任何癥狀，影像學表現(xiàn)為雙側(cè)，不對稱，伴有肺容積縮小； 隨著時間越長久到了晚期患者表現(xiàn)為咳嗽、進行性呼吸困難、活動后明顯，肺部出現(xiàn)網(wǎng)狀影，牽拉性支擴、蜂窩影多見，外周及兩肺底分布，新老病灶共存。

綜上所述，本實驗以A549 上皮細胞為模型，從細胞外形到基因及蛋白表達，研究在不同時間段，TGF-β1 誘導EMT 發(fā)生的關(guān)系。 最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外實驗，EMT 發(fā)生與TGF-β1 刺激的時間長短有關(guān)。提示72h 和48h 為為體外實驗EMT 發(fā)生的時間，但48h 只能影響到上皮細胞標志物的表達，對間質(zhì)細胞標志物的表達影響不大，其在72h 二者表達均很明顯。 研究結(jié)果亦符合臨床實際，EMT 為腫瘤和纖維化疾病發(fā)病的重要機制，這些疾病發(fā)病大多數(shù)為老年病患，其形成是長年累月的最終結(jié)果。 本實驗下一步研究可探討某些通路在不同時間段的基因和蛋白表達水平，進一步了解EMT 發(fā)生機制，從而助于臨床對腫瘤和纖維化等疾病的預防和治療。