陳少源 方紅城 黃于朗 林小龍 劉榮志 方葉青 謝培益

518052 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳南山醫(yī)院心血管內(nèi)科(陳少源、林小龍、劉榮志、方葉青、謝培益)；518104 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院心血管內(nèi)科(方紅城)；518067 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院深圳醫(yī)院心血管內(nèi)科(黃于朗)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是臨床上最常見的血管疾病之一。AS斑塊中存在多種炎癥細(xì)胞和因子[1]。促炎因子與抗炎因子是重要的影響因素，兩者在特定情況下可相互影響。研究表明，炎癥反應(yīng)中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的激活及其釋放的細(xì)胞因子(如基質(zhì)金屬蛋白酶9、白細(xì)胞介素18等)對促使AS斑塊的不穩(wěn)定、破裂起著重要的作用[2-3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素37(interleukin 37，IL-37)有抑制固有免疫應(yīng)答的作用[4]。IL-37能降低促炎因子的產(chǎn)生，其增加與多種慢性病及自身免疫性疾病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[5]。研究顯示，AS斑塊的泡沫樣細(xì)胞表達(dá)IL-37，提示IL-37可能對AS產(chǎn)生保護(hù)作用。而Smad3是參與AS的炎癥信號的重要通路之一[6]。IL-37參與AS的過程可能與Smad3有關(guān)，但相關(guān)研究較少。本研究通過兔腹主動脈AS模型檢測IL-37/Smad3的表達(dá)，探討它們對AS的影響，并評估阿托伐他汀對AS斑塊中IL-37/Smad3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

20只純種新西蘭雄性大白兔購自并飼養(yǎng)于中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK(粵)2017-0081]。動物房溫度保持(22±2)℃，相對濕度保持在40%～60%，日照時(shí)間8：00～20：00。實(shí)驗(yàn)前3 d灌服阿司匹林6 mg/kg。實(shí)驗(yàn)動物按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對照組(4只)：球囊損傷兔腹主動脈后普通飲食喂養(yǎng)12周；實(shí)驗(yàn)組(8只)：球囊損傷兔腹主動脈后給予高脂飼料(1%膽固醇、5%蛋黃、5%豬油、89%標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天120～140 g/只)喂養(yǎng)12周；藥物組(8只)：與實(shí)驗(yàn)組動物同時(shí)、同條件下建立AS模型，高脂喂養(yǎng)6周后改為普通飲食并給予阿托伐他汀1 mg·kg-1·d-1，再喂養(yǎng)6周。3組動物在建模當(dāng)天、喂養(yǎng)6周和12周檢測血脂和IL-37，12周時(shí)靜脈注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉處死取腹主動脈行相關(guān)檢查。本研究符合中山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理要求，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 血清學(xué)檢查

血液經(jīng)2000 r/min離心20 min獲得血清。通過全自動血液化學(xué)分析儀分析，檢測血清中總膽固醇(cholesterol， TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)和三酰甘油(triglyceride， TG)的水平。計(jì)算動脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index，AI)。AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定血清IL-37，按試劑生產(chǎn)商(Cat Rapidbio)使用說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色

超薄切片機(jī)對石蠟包埋組織塊進(jìn)行切片、固定于載玻片上。在室溫下過夜干燥，然后進(jìn)行染色。

1.4 免疫組化及免疫熒光分析

甲醛固定腹主動脈，用抗IL-37和Smad3的多克隆抗體，行IL-37和Smad3免疫染色。3組腹主動脈的脂紋病變通過用蘇丹Ⅲ或肉眼觀察染色鑒定。所有抗體來自Abcam公司(ab57187)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

取適量RIPA裂解液勻漿組織，測蛋白濃度后，各樣品取50 μg的總蛋白。蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝膠中分離，把蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑0.1 μm的硝酸纖維素膜上。非特異性結(jié)合蛋白用含5%的脫脂牛奶緩沖溶液(TBS： 40 mM Tris，300 mM NaCl，pH 7.6)進(jìn)行室溫下封閉1 h，隨后膜在TBST洗滌后加入BCL-2抗體(Abcam)孵育。兔源Smad3抗體和IL-37抗體購自Zymed Laboratories(51-1500)及Abcam公司(ab57186)。

1.6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測

用aRNeasy試劑盒提取新鮮外周血細(xì)胞RNA。通過放大轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因(GAPDH)定量RT-PCR的cDNA。以下為特異引物：兔IL-37上游引物是5’-TCACCGAGAAGGAGCAAGCA-3’；IL-37下游引物是5’-ACGGGTTCACCAGAAGAGCA-3’。兔Smad3上游引物是5’-AGACCAGCGACCAGATGAAC-3’；兔Smad3下游引物是5’-AGTAGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’。GAPDH利用下列引物進(jìn)行分析：編碼鏈：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；反義鏈：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。定量PCR應(yīng)用ABI PRISM 7900測序系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組的體重和生化指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間，無實(shí)驗(yàn)動物死亡。與實(shí)驗(yàn)組、藥物組相比，對照組的體重在6～12周時(shí)增加明顯。藥物組經(jīng)阿托伐他汀處理后體重下降。實(shí)驗(yàn)組的血脂和AI較對照組明顯升高(均為P<0.05)，而藥物組在6周后各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常，見表1。

2.2 3組的血清IL-37的表達(dá)水平

對照組中IL-37無明顯增加。實(shí)驗(yàn)組IL-37表達(dá)量從基線到12周逐漸增加。與實(shí)驗(yàn)組相比，藥物組IL-37的表達(dá)明顯降低(均為P<0.05)，見表2。

2.3 3組的血管病理形態(tài)學(xué)

對照組的腹主動脈管腔規(guī)則，內(nèi)膜完整光滑，內(nèi)彈力板連續(xù)，中膜平滑肌細(xì)胞呈梭形、排列規(guī)整。實(shí)驗(yàn)組的腹主動脈可見典型的AS形成，向管腔內(nèi)隆起的斑塊表面內(nèi)皮細(xì)胞缺失，內(nèi)彈力板增厚、斷裂，大量的脂肪細(xì)胞積于內(nèi)膜，使內(nèi)膜變厚，而中膜受壓變薄，管腔狹窄不規(guī)則；染色質(zhì)邊聚，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的脂質(zhì)空泡形成。藥物組的腹主動脈同樣可見AS形成，內(nèi)皮細(xì)胞缺失，內(nèi)彈力板增厚，可見脂肪細(xì)胞及脂質(zhì)空泡形成，內(nèi)膜、肌層明顯變厚及管腔狹窄，但對比模型組泡沫細(xì)胞明顯減少，管腔狹窄程度有所減輕，見圖1。

2.4 3組腹主動脈中IL-37和Smad3的表達(dá)水平

泡沫化損傷及高脂飲食在腹主動脈中引起AS斑塊，實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)大量的泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，藥物組的泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集減少。實(shí)驗(yàn)組炎癥細(xì)胞中IL-37的表達(dá)最高，藥物組的表達(dá)量明顯降低，而對照組最低(圖2)，3組間的Smad3的表達(dá)相似，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)最高，藥物組明顯降低，而對照組最低(圖3)。

表1 3組間體重、血脂和AI比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，bP<0.05；與基線比較，cP<0.05；與6周比較，dP<0.05

表2 3組間血清IL-37表達(dá)水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，bP<0.05；與基線比較，cP<0.05；與6周比較，dP<0.05

圖1 3組血管病理學(xué)形態(tài)

2.5 3組IL-37和Smad3在AS斑塊中的表達(dá)水平

處死動物后在AS斑塊中發(fā)現(xiàn)，IL-37、Smad3在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)最高，藥物組稍低，而對照組表達(dá)最低(P<0.001)。Western blot結(jié)果提示，IL-37與Smad3呈高度直線相關(guān)(r=0.929，P<0.001)；RT-PCR結(jié)果提示，IL-37與Smad3亦呈高度直線相關(guān)(r=0.942，P<0.001)，見表3。

圖2 3組腹主動脈IL-37的免疫組化

3 討論

圖3 3組腹主動脈Smad3的免疫組化

AS主要特征是動脈內(nèi)壁細(xì)胞、LDL-C、細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，而多種炎癥標(biāo)記物可在AS斑塊中表達(dá)[7]。IL-37是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗炎作用的白介素家族成員，在AS發(fā)生、發(fā)展中有特殊的作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-37參與免疫調(diào)節(jié)的重要過程[2， 8-9]。IL-37的增加可能是結(jié)果而非AS的促炎細(xì)胞因子[10]。Smad3是一種抗炎信號通路轉(zhuǎn)化生長因子β。在IL-37過表達(dá)的A549細(xì)胞中，活化刺激反應(yīng)可降低與IL-37結(jié)合磷酸化Smad3[5]，提示Smad3參與IL-37的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組血清IL-37水平較對照組明顯上升，阿托伐他汀干預(yù)可降低其水平，但仍比對照組升高。在第12周時(shí)，Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-37與血清中的變化相一致。故IL-37可能參與AS過程。IL-37可能依賴激活的腺苷酸激活蛋白激酶的平衡促炎反應(yīng)，亦可直接抑制免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Boraschi等[11]發(fā)現(xiàn)IL-37在狼瘡患者的單核細(xì)胞中表達(dá)顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-37在血管內(nèi)皮細(xì)胞、特別是斑塊處出現(xiàn)明顯的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞富集。免疫組化結(jié)果也顯示，在巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)IL-37的聚集，均提示IL-37與AS密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，他汀可明顯降低AS炎癥程度，且降低循環(huán)中炎癥標(biāo)記物水平[12-13]。本研究顯示，阿托伐他汀治療后IL-37較實(shí)驗(yàn)組呈下降趨勢，但仍比對照組高。阿托伐他汀減少IL-37在AS斑塊中的表達(dá)，機(jī)制是在細(xì)胞水平上抑制了樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化[14]；或在分子水平上抑制了促炎因子分泌。IL-37的降低可能是抗炎因子作用或是一種附帶現(xiàn)象，目前尚未明確。IL-37在疾病不同發(fā)展階段呈動態(tài)變化，故不同檢測時(shí)間可能影響血清IL-37水平[9]。

表3 3組間AS斑塊中IL-37和Smad3的表達(dá)水平

注：與對照組比較，aP<0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，bP<0.05

此外，IL-37可通過改變Smad3的表達(dá)影響AS過程[8，11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在斑塊的泡沫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，IL-37和Smad3表達(dá)呈同步上升，相關(guān)性分析提示二者高度相關(guān)，提示Smad3的活化可能與IL-37密切相關(guān)，而阿托伐他汀能同步抑制IL-37/Smad3表達(dá)。

本研究存在一定局限性：由于實(shí)驗(yàn)動物為兔，其為草食性動物，對照組在實(shí)驗(yàn)過程中采用普通飲食體重逐步增加，而實(shí)驗(yàn)組和藥物組隨著時(shí)間延長，高脂飲食特別是他汀類藥物氣味等因素可能影響其食欲或其生長，故可對體重產(chǎn)生一定影響，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。總之，IL-37和Smad3在AS斑塊中表達(dá)增高，IL-37/Smad3可能參與AS的調(diào)節(jié)過程，阿托伐他汀可降低IL-37/Smad3的表達(dá)。

利益沖突：無