劉凱 李子健

100191 北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科，血管醫(yī)學(xué)研究所，國家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點實驗室，分子心血管學(xué)教育部重點實驗室，心血管受體研究北京市重點實驗室

血管重構(gòu)是許多心血管疾病共有的病理生理過程之一，包括管壁細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡等，引起血管舒縮功能紊亂[1]。其發(fā)病機制包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAS)過度激活、活性氧(reactive oxygen species， ROS)的失衡[2]、血流動力學(xué)刺激[3]等。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， Ang Ⅱ)是RAS的主要效應(yīng)肽，通過激活其受體AT1R(angiotensin type 1 receptor)，促進(jìn)血管的炎癥過程和膠原沉積，導(dǎo)致管壁增厚和血管纖維化，促進(jìn)血管重構(gòu)[4]。Ang Ⅱ能加重高血壓大鼠的血管重構(gòu)，拮抗AT1R能減少纖維化[5]。在系膜細(xì)胞中，AngⅡ能激活轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，促進(jìn)纖維化，但抑制蛋白激酶C和p38絲裂原活化蛋白激酶依賴的通路后，AngⅡ不能促進(jìn)TGF-β1的激活增加[6-7]。同時，半乳糖凝集素3與AngⅡ誘導(dǎo)的纖維化密切相關(guān)。敲除半乳糖凝集素3后，AngⅡ誘導(dǎo)的纖維化受抑制[8]。在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中給予半乳糖凝集素3亦能減少膠原沉積[6，9]，但AT1R及其下游信號介導(dǎo)血管重構(gòu)中膠原沉積的分子機制尚不清楚。

HIP-55(HPK1-interacting protein of 55 kDa)，也稱為SH3P7、mAbp1和DBNL(the adaptor protein Drebrin-like)，是一種含有多個蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，其N端、C端分別有肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和SH3結(jié)構(gòu)域。HIP-55在許多細(xì)胞生理過程中起重要作用，如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)吞作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)HIP-55表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]、促進(jìn)中性粒細(xì)胞的擴散和遷移[12]、調(diào)節(jié)發(fā)育中大腦皮層中的N-鈣粘蛋白表達(dá)來控制神經(jīng)元遷移[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIP-55在異丙(去甲)腎上腺素誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)增高，而HIP-55通過腎上腺素受體可抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖，但HIP-55在血管系統(tǒng)中的功能機制仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗體：HIP-55(sc-366772)購自Santa Cruz公司；GAPDH(2118s) 購自CST公司；Ang Ⅱ(1158) 購自Tocris公司；二周緩釋泵(1002)購自Alzet公司；Masson染色試劑盒購自貝索公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0010，所有動物實驗遵守北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫mRNA表達(dá) 使用NCBI平臺檢索HIP-55和Ang Ⅱ，分析AT1R抑制劑坎地沙坦對大鼠高血壓模型HIP-55(DBNL)表達(dá)的影響。

1.2.2HIP-55基因敲除小鼠構(gòu)建及鑒定 利用TALEN技術(shù)制備HIP-55基因全身敲除小鼠(廣州賽業(yè))。設(shè)計和構(gòu)建2～3個不同位點的TALEN載體，并將構(gòu)建好的TALEN 載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。得到的針對不同位點的mRNA分別注射到B6品系受精卵，顯微注射后的受精卵回送到代孕母鼠輸卵管中，最終得到經(jīng)測序鑒定的F1代HIP-55基因敲除小鼠。

提取小鼠尾尖DNA，通過離心抽提獲得微量羽毛狀DNA，加入去離子水，DNA濃度大致為200 μg/L。PCR：PCR程序設(shè)置：98.0℃，30 s；98.0℃，5 s；65.0℃，5 s；72.0℃，7 s(30次循環(huán))；72.0℃，1 min。PCR引物序列如下：上游引物： AAGTGCTGGGATTAAAGGCGTGC。下游引物： GTCACTGTAGCTGAGCTGGAGGAAGA。PCR產(chǎn)物酶切跑膠，結(jié)果為基因敲除鼠：約500 bp處有一條帶。野生型(WT)鼠：約250 bp處有兩條帶。雜合子：有三條帶，約500 bp處有一條帶，約250 bp處有兩條帶。

1.2.3 小鼠血管重構(gòu)模型建立及血壓監(jiān)測 通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，皮下植入AngⅡ的滲透緩釋泵14 d(1 mg·kg-1·d-1)。在埋泵前一天及埋泵第7天和第14天，使用大小鼠無創(chuàng)血壓儀(BP98A，Softron，日本)測量小鼠血壓。

1.2.4 分組 構(gòu)建HIP-55基因敲除鼠后，將小鼠分為4組：野生/假手術(shù)組(WT/Sham組)、HIP-55基因敲除/假手術(shù)組(HIP-55-/-/Sham組)、野生/埋泵組(WT/Ang Ⅱ組)和HIP-55基因敲除/埋泵 (HIP-55-/-/Ang Ⅱ組)。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)檢測 小鼠麻醉后處死取材，將血管固定在甲醛中，包埋在石蠟中，并切成厚度為5 μm的石蠟切片。通過蘇木素-伊紅(HE)染色用于檢查血管形態(tài)的變化，通過Masson染色評估血管中的膠原沉積情況。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 將血管組織裂解物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%牛奶封閉，然后將膜在4℃下孵育HIP-55(1∶1000)和GAPDH (1∶10000)一抗過夜。在室溫下二抗孵育1 h后，使用化學(xué)發(fā)光法顯現(xiàn)免疫反應(yīng)蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高血壓模型大鼠的HIP-55表達(dá)

使用GEO數(shù)據(jù)庫搜索項“HIP-55(DBNL)和Angiotensin”檢索原始數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)在高血壓大鼠模型中給予AT1R抑制劑坎地沙坦，HIP-55的表達(dá)量有降低趨勢(0.7±0.01比1.0±0.08，P=0.07)，提示HIP-55可能參與AT1R下游信號。

2.2 小鼠血管重構(gòu)模型

建立血管重構(gòu)模型后，埋泵前實驗組和對照組的血壓相似；埋泵后第14天后，實驗組小鼠的收縮壓[(133.4±3.4)mmHg比(103.0±1.0)mmHg，P<0.001]和舒張壓[(103.9±1.0)mmHg比(82.8±0.9)mmHg，P<0.001]均顯著升高。與對照組相比，實驗組小鼠的血管膠原沉積(3.1±0.18比1.1±0.04，P<0.01)(圖1A)、血管橫切平均面積(2.7±0.1比1.0±0.04，P<0.01)、平均厚度[(105.7±7.0)μm比(66.0±7.6)μm，P<0.01]、平均厚度/內(nèi)徑(0.28±0.01比0.17±0.01，P<0.01)均明顯增加(圖1B)，故小鼠血管重構(gòu)模型構(gòu)建成功。

2.3 小鼠血管重構(gòu)模型HIP-55表達(dá)水平

與對照組相比，實驗組小鼠血管中HIP-55 mRNA(1.6±0.22比1.0±0.03，P<0.01)和HIP-55蛋白表達(dá)水平(1.6±0.15比1.0±0.04，P<0.01)均明顯增加(圖2)，故HIP-55可能參與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

2.4 HIP-55促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的膠原沉積

利用TALEN技術(shù)建立HIP-55敲除小鼠，使用鼠尾基因型鑒定和Western blot的方法證明HIP-55基因敲除小鼠建立成功(圖3A、B)。結(jié)果顯示：與WT/Sham組相比，HIP-55-/-/Sham組小鼠的血管膠原沉積水平無明顯變化(1.1±0.04比1.0±0.05，P=0.70)；給予AngⅡ埋泵后，與WT/Ang Ⅱ組相比，HIP-55-/-/Ang Ⅱ組小鼠的血管膠原沉積程度明顯減少(2.6±0.2比3.3±0.1，P<0.05)，故HIP-55介導(dǎo)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管膠原沉積(圖3C)。

A：Masson染色；B：HE染色圖1 小鼠血管重構(gòu)模型構(gòu)建

圖2 小鼠血管重構(gòu)模型中HIP-55蛋白表達(dá)

3 討論

血管重構(gòu)是一種復(fù)雜而動態(tài)的血管刺激反應(yīng)過程，其發(fā)生發(fā)展及相關(guān)并發(fā)癥的主要病理基礎(chǔ)是血管膠原沉積引起的血管損傷[14]。血管膠原沉積發(fā)生的已知機制包括：TGF-β/SMAD信號傳導(dǎo)，激活TGF-β及下游的SMAD信號，促進(jìn)膠原蛋白的合成[15]；ROS的過量生成會促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和結(jié)締組織生長因子的增加，促進(jìn)膠原沉積，導(dǎo)致纖維化和動脈硬度增加[16]；半乳糖凝集素3的上調(diào)可直接增加膠原蛋白的增加，促進(jìn)膠原沉積[17]。另外，RAS系統(tǒng)通過激活A(yù)T1R、鹽皮質(zhì)激素受體和內(nèi)皮素受體，導(dǎo)致膠原沉積。其中，血管緊張素作用于AT1R，激活MMP、結(jié)締組織生長因子和TGF-β，導(dǎo)致膠原沉積[18]。醛固酮可通過鹽皮質(zhì)激素受體促進(jìn)膠原沉積。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠中，醛固酮能增加膠原沉積；阻斷鹽皮質(zhì)激素受體后，能減少心血管的膠原沉積水平[19]，而內(nèi)皮素1通過內(nèi)皮素受體促進(jìn)膠原沉積。阻斷內(nèi)皮素受體可顯著減少MMP-2的活性，抑制膠原沉積[20]。在衰老和高血壓的過程中，脈管系統(tǒng)最明顯的特點是血管膠原沉積，導(dǎo)致纖維化和硬化。

干擾Ang Ⅱ藥物，即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體阻滯劑，能減少血管膠原沉積，降低動脈僵硬度[21]，改善膠原沉積，降低心腦血管事件的發(fā)生。因此，減少血管膠原沉積是解決高血壓血管重構(gòu)的有效辦法之一。然而，目前尚無較好的干預(yù)手段，闡明新的促進(jìn)膠原沉積的機制是未來干預(yù)血管重構(gòu)的理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于HIP-55的文獻(xiàn)報道主要是在器官發(fā)育、免疫反應(yīng)和神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面起著重要作用，在血管中的作用尚無人報道。我們首次發(fā)現(xiàn)在AngⅡ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)模型中HIP-55的表達(dá)是增加的，并且HIP-55介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的血管膠原沉積。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HIP-55能通過P38 MAPK途徑抑制ISO誘導(dǎo)的心臟纖維化。雖然刺激因素以及部位不同，但這也給我們提示，HIP-55是否也會通過P38 MAPK這一途徑影響AngⅡ誘導(dǎo)的膠原沉積。因此，HIP-55是如何影響AngⅡ介導(dǎo)的血管膠原沉積還亟待研究[21]。

A：鼠尾基因鑒定結(jié)果；B：蛋白水平敲除結(jié)果；C：膠原沉積變化圖3 HIP-55對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管膠原沉積影響

本文也有不足之處：(1)AngⅡ誘導(dǎo)的血管重構(gòu)除了有膠原沉積增加外，還有平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化等，本文只研究了HIP-55對AngⅡ誘導(dǎo)的膠原沉積的影響；(2)HIP-55是如何影響AngⅡ介導(dǎo)的血管膠原沉積的進(jìn)一步機制還亟待研究?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)HIP-55在血管重構(gòu)模型中增加，表明HIP-55響應(yīng)血管重構(gòu)的病理刺激；敲除HIP-55能減少Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管膠原沉積。因此，HIP-55是一個潛在的抑制血管重構(gòu)的靶點，未來可通過干預(yù)血管中HIP-55的表達(dá)或抑制HIP-55的活性，進(jìn)而治療血管重構(gòu)。

利益沖突：無