何俏穎 沈 醉 佘麗嬌 朱怡霖 方劍喬 邵曉梅

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310053）

已有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)過(guò)去的疼痛產(chǎn)生的疼痛記憶會(huì)影響以后的疼痛經(jīng)歷并在慢性疼痛的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而疼痛經(jīng)歷和疼痛伴發(fā)情緒在疼痛記憶中共同起著關(guān)鍵作用[1]。疼痛伴發(fā)情緒作為疼痛記憶中的重要組成維度，是目前使疼痛病人的生活質(zhì)量極大降低的重要原因，因此認(rèn)識(shí)疼痛記憶過(guò)程中伴發(fā)情緒的調(diào)節(jié)機(jī)制越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

疼痛記憶伴隨的疼痛感覺(jué)和疼痛誘發(fā)情緒主要由大腦中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)制，以往研究表明一些大腦區(qū)域，包括內(nèi)側(cè)丘腦、前扣帶皮層、杏仁核的中央、基底外核及紋狀體尾狀核[2]，其中內(nèi)側(cè)丘腦，是內(nèi)側(cè)疼痛系統(tǒng)的重要組成部分，可將脊髓獲得的不同類型傷害性信息進(jìn)行存儲(chǔ)和整合通過(guò)脊髓丘腦束將信息傳入皮層的重要中繼站，其中喙側(cè)內(nèi)側(cè)丘腦(medial thalamus,MT)涉及到疼痛的情感和動(dòng)機(jī)方面[3]。Isseroff等[4]研究發(fā)現(xiàn)如果內(nèi)側(cè)丘腦受損，傷害性感受和情景記憶之間的聯(lián)系將不能形成或延緩形成；中央內(nèi)側(cè)丘腦核參與疼痛情緒維度被認(rèn)為取決于其對(duì)前扣帶皮層（24區(qū)）和基底外側(cè)杏仁核的強(qiáng)烈投射[5]。多方研究表明MT參與將傷害性信息傳至大腦皮層，并在疼痛過(guò)程中對(duì)疼痛誘發(fā)情緒也有參與作用。目前未有研究明確MT是否可能參與疼痛記憶形成過(guò)程中的厭惡性情緒的產(chǎn)生及減弱或消除過(guò)程。

電針是針灸臨床鎮(zhèn)痛常用的治療方法，多方臨床及前臨床研究表明針灸對(duì)慢性疼痛、疼痛記憶的疼痛感覺(jué)及疼痛情緒的改善療效明確[6,7]，然而目前尚未有電針抑制痛記憶的喚醒及疼痛誘發(fā)情緒的中樞相關(guān)神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，而MT作為與疼痛感知及誘發(fā)情緒相關(guān)的一個(gè)信息整合及傳遞的重要核團(tuán)[8]，是否參與由繼發(fā)性損傷引起疼痛記憶的誘發(fā)情緒過(guò)程，并且電針對(duì)疼痛記憶模型大鼠疼痛誘發(fā)情緒的干預(yù)機(jī)制是否通過(guò)MT這一核團(tuán)實(shí)現(xiàn)，等機(jī)制仍有待深入研究。因此在本次研究中，擬通過(guò)MT核團(tuán)定向電損毀術(shù)，觀察MT在疼痛記憶模型大鼠伴發(fā)厭惡性情緒中的作用及電針干預(yù)作用，從痛感覺(jué)和痛情緒的較新層面和較深層次闡述疼痛記憶的形成和電針干預(yù)機(jī)制，揭示電針對(duì)疼痛記憶形成過(guò)程中疼痛誘發(fā)情緒的中樞干預(yù)機(jī)制是否通過(guò)作用于MT這一核團(tuán)實(shí)現(xiàn)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠51只，體重285～315 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按分層隨機(jī)化法將大鼠分成5組：空白組(C)、模型組(M) 10只、模型+電針組(M+EA)10只、損毀+模型組(L+M) 10只、損毀+模型+電針組(L+M+EA) 11只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置遵照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，室溫23～25 ℃，濕度40%～60%，自由飲水與進(jìn)食。

2.主要試劑及儀器

0.9%氯化鈉注射液（杭州民生藥業(yè)有限公司）；碘伏（江西健寶醫(yī)藥科技有限公司）；水合氯醛（上海展云化工有限公司）；3.0%過(guò)氧化氫（浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司）；角叉菜膠(carrageenan,Carr)(Sigma Chemical Co,St.Louis,MO,USA)；75%醫(yī)用消毒酒精（杭州歐拓普生物技術(shù)有限公司）；尼氏(Nissl)染色液（C0117，碧云天）；數(shù)字顯示腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；體視顯微鏡（XTZ-03，上海光學(xué)儀器一廠）；電動(dòng)牙科鉆（上海醫(yī)用分析儀器廠）；電損毀儀（#53500,UGO Basile,Italy）；動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀（#37450,UGO Basile,Italy）；ZAP膠（臺(tái)灣）；體溫維持儀-大鼠型（69000，深圳瑞沃德生命科技有限公司）；韓氏電針儀（HANS 200E，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司）；不銹鋼顱骨固定螺釘（格羅貝爾生物科技公司）；SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)(Panlab,Spain)；冰凍切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific,USA)。

3.MT損毀術(shù)

手術(shù)當(dāng)天取L+M組、L+M+EA組大鼠，采用7%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔麻醉，備皮。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。大鼠頭頂部皮膚經(jīng)消毒后采用眼科剪將皮膚剪開(kāi)充分暴露顱骨的前囟、后囟和前額葉視野。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜（第六版）確定內(nèi)側(cè)丘腦(medial thalamus,MT)的方位參數(shù)(2.76 mm posterior to bregma,±0.9 mm mediolateral,5.2 mm dorsoventral)，并于各點(diǎn)做好標(biāo)記。以牙科鉆在顱骨表面小心打磨，穿透硬腦膜，直至在顯微鏡下可以觀察到腦實(shí)質(zhì)，然后將損毀電極經(jīng)液壓微驅(qū)動(dòng)器緩慢推進(jìn)電極末端至MT，將損毀電極上的線與電損毀儀相連接，啟動(dòng)輸出恒定直流電。損毀參數(shù)：直流電，強(qiáng)度1 mA，頻率50 Hz，持續(xù)30 s。完畢后待紅色LED指示燈熄滅，關(guān)閉電源，移除電損毀儀。

4.造模與電針干預(yù)方法

根據(jù)Kissin等[9]的二次足底注射角叉菜膠的方法制備疼痛記憶模型。M組、M+EA組、L+M組、L+M+EA組大鼠分別在造模當(dāng)天采用生理鹽水配置的2%的Carr于左后足足底注射，劑量為100 μl，以誘導(dǎo)急性炎性痛，Carr首次左后足注射后14 d再次以同濃度同劑量的Carr于大鼠右后足足底注射。C組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)相同位置注射同劑量生理鹽水。

L+M+EA組大鼠于Carr首次左后足注射造模后第5 h、1～5 d予EA干預(yù)治療。取穴：雙側(cè)“后三里”及其下方1 cm處（李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》），每日1次，共6次。毫針規(guī)格：0.3 mm×13 mm。電針參數(shù)：恒流方波輸出（脈沖寬度：0.6 ms 2 Hz，0.2 ms 100 Hz），頻率2/100 Hz，強(qiáng)度1～2 mA（起始1 mA，以后每隔10 min增加0.5 mA）。電針持續(xù)時(shí)間：30 min。L+M組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)僅進(jìn)行抓取固定。

5.取材及后固定

L+M組、L+M+EA組大鼠Carr二次右后足注射后2 d，行7%水合氯醛腹腔麻醉并處死大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛灌注、滴注后迅速取出大腦，多聚甲醛浸泡過(guò)夜，再經(jīng)15%、30%蔗糖梯度脫水后放置入-80℃冰箱保存，備用于后續(xù)的冰凍切片及尼氏染色。

6.檢測(cè)方法

（1）痛感覺(jué)檢測(cè)

采用動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀機(jī)械測(cè)痛方法檢測(cè)大鼠后足縮足閾(paw withdrawal threshold,PWT)作為機(jī)械痛閾值。每次檢測(cè)時(shí)間為9:00 am～12:00 am。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：室內(nèi)溫度23～25℃，濕度45%～55%，噪音40分貝以下。

PWT檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為：-1 d、Carr首次注射后4 h、1 d、5 d、13 d及15 d，測(cè)痛部位為左右后足足趾部。將大鼠單獨(dú)放入底面為鐵絲網(wǎng)的透明有機(jī)玻璃盒中，蓋上透氣蓋，適應(yīng)15 min左右，直到大鼠停止探索、理毛、洗臉等活動(dòng)后，開(kāi)始檢測(cè)。動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀上一不銹鋼探針（直徑0.5 mm）垂直上升至大鼠后足掌底中央部（避開(kāi)足墊）后，再以速度為2.5 g/s逐漸增大刺激強(qiáng)度（刺激最大值為50 g），當(dāng)大鼠發(fā)生縮足反應(yīng)后探針立即停止，觸覺(jué)儀自動(dòng)記錄縮足時(shí)的壓力值，即為大鼠該次測(cè)量的PWT值。同法連續(xù)檢測(cè)5次，每次間隔1～2 min，取其后四次的平均值作為PWT值。

主要統(tǒng)計(jì)Carr首次注射后各時(shí)間點(diǎn)PWT與Carr首次注射前PWT的差值(paw withdrawal threshold difference value,PWT D-value)。

（2）CPA檢測(cè)

對(duì)Hummel等[10]的條件性位置范式進(jìn)行修改，自制偏愛(ài)性情緒記憶范式箱體，并根據(jù)疼痛記憶模型的特點(diǎn)制定檢測(cè)厭惡性情緒的方案。每次檢測(cè)時(shí)間為9:00 am～4:00 pm。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：室內(nèi)溫度23～25℃，濕度45%～55%，噪音40分貝以下。

條件性位置厭惡范式箱體分為兩個(gè)等大的箱體(35 cm×28 cm×45 cm)，中間一擋板可控制箱體獨(dú)立或開(kāi)放，分別用不同顏色（黑色和白色）、不同寬度條紋（3 cm寬和9 cm寬）的壁紙相間組合粗細(xì)條紋箱，底部為加網(wǎng)柵板（網(wǎng)格1 cm2左右）。在厭惡性情緒記憶范式箱體的正上方安裝一攝像機(jī)，調(diào)整好影像畫面。采用SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)的視頻采集軟件自動(dòng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，并進(jìn)行實(shí)時(shí)錄像和數(shù)據(jù)分析，觀察并記錄每只大鼠在30 min內(nèi)兩個(gè)箱體的活動(dòng)時(shí)間。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程分為三個(gè)階段：

第一階段為條件化前(pre)：Carr首次左后足注射前1 d，箱體之間開(kāi)放（去除中間擋板），觀察大鼠30 min內(nèi)在兩箱體中的活動(dòng)情況。根據(jù)所有大鼠在兩個(gè)箱體的時(shí)間，隨機(jī)分配每只大鼠的條件箱和非條件箱。

第二階段為條件化：Carr首次左后足注射當(dāng)天(0 d)，在造模前30 min將中間擋板關(guān)閉，成為兩個(gè)獨(dú)立的箱體，將各組大鼠置于非條件箱中自由活動(dòng)30 min以非條件化。Carr首次左后足注射后的第4 h開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行條件化訓(xùn)練30 min，此時(shí)間段擋板仍關(guān)閉。前5 min使大鼠在條件箱中適應(yīng)，后25 min對(duì)大鼠左后足足底進(jìn)行連續(xù)25次機(jī)械刺激（動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀調(diào)節(jié)參數(shù)為：以5 s內(nèi)達(dá)到最大刺激值50 g的速度），每次刺激之間間隔1 min，記錄刺激過(guò)程中抬足次數(shù)。

第三階段為條件化后(post)：各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為1 d、5 d、13 d、15 d。此期間檢測(cè)過(guò)程中中間擋板被拆除，分別記錄每只大鼠在條件箱中的活動(dòng)時(shí)間。

主要觀察的指標(biāo)是CPA score值。CPA score值是條件化后(1 d)大鼠在條件箱自由活動(dòng)的時(shí)間Tpost減去條件化前大鼠在條件箱活動(dòng)時(shí)間Tpre-的差值(Tpost- Tpre),即 Tscore= Tpost- Tpre，來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的痛厭惡情緒的情況。

（3）曠場(chǎng)

各組大鼠于Carr首次左后足注射后第16 d進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以評(píng)判大鼠自發(fā)性探索運(yùn)動(dòng)活性及焦慮樣行為。每次檢測(cè)時(shí)間為9:00 am～12:00 am。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：室內(nèi)溫度23～25℃，濕度45%～55%，噪音40分貝以下。

曠場(chǎng)是一1 m×1 m的正方體無(wú)蓋木箱，將底邊的縱橫四邊均勻分成4等分，共16小格。將外周12小格定義為外周區(qū)域，中間4小格定義為中央?yún)^(qū)域。在曠場(chǎng)的正上方安裝攝像機(jī)，調(diào)整好影像畫面。采用SMART V3.0小動(dòng)物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)記錄并分析10 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。主要記錄大鼠在中央?yún)^(qū)域、外周區(qū)域的活動(dòng)時(shí)間，進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)，在中央?yún)^(qū)域、外周區(qū)域的總運(yùn)動(dòng)路程。

（4）尼氏染色

從-80℃冰箱中取出腦組織，于冰上沿下丘腦從背側(cè)向腹側(cè)垂直切下，留前部分平擺于提前滴上OCT的凍頭上，速置于冰凍切片機(jī)中復(fù)溫約30 min。將復(fù)溫好的腦組織連同凍頭夾緊固定于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗/進(jìn)退鍵，調(diào)整好切片角度，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。調(diào)好欲切的厚度(FINE: 50 μm;TRIM:50 μm)，開(kāi)始冷凍冠狀位連續(xù)切片，切片時(shí)，輕揭蓋防卷板，以切出完整、平滑、不卷曲的切片為準(zhǔn)，注意避免產(chǎn)生氣泡，將粘附有腦組織切片的載玻片置于烘片機(jī)上過(guò)夜。將尼氏染色液置于37℃水浴箱中預(yù)熱30 min，將粘附有腦片的載玻片于蒸餾水中浸泡5 s取出，將尼氏染色液滴于切片組織上（每個(gè)腦片4～5滴），置于37℃水浴箱中染色10 min，使染色均勻。于蒸餾水中洗滌2次（每次數(shù)秒即可）。先后于90%、70%的乙醇中分別浸泡1遍、2遍，每遍約10 s，最后在體視顯微鏡下觀察MT損毀的位置。在本實(shí)驗(yàn)中，L+M組、L+M+EA組大鼠大腦的冠狀位冰凍切片取前囟后2.16～3.48 mm，中線旁開(kāi)± 0.9 mm，顱骨下5.3 mm觀察MT損毀位置。其示意圖如圖1所示，此兩組大鼠大腦經(jīng)冠狀位冰凍切片觀察有7只大鼠損毀位置不在MT正確位置內(nèi)，損毀電極放置正確率為75%，不在正確損毀位置內(nèi)的大鼠予剔除，且不計(jì)入行為學(xué)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7.統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)。其中各組大鼠左后足Carr首次注射后1 d、5 d及Carr二次右后足注射后5 d PWT 方差不齊，采用Dunnett' s T3檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.組織學(xué)結(jié)果

MT損毀位置及代表切片示意圖見(jiàn)圖1。

2.各組大鼠PWT D-value值比較。

如圖2所示，圖2A和圖2B分別為Carr首次及二次注射后左右后足PWT D-value值。如圖2A所示，造模后4 h、1 d，與C比較，其余四組PWT D-value值均顯著降低(P＜0.01)，提示Carr首次注射后造模成功，且在造模后1 d大鼠PWT仍保持較低水平。Carr首次注射后13 d，Carr注射后的四組大鼠痛閾基本恢復(fù)至造模前水平。Carr二次右后足注射后，與C組比較，M組大鼠未注射足（左后足）PWT D-value值顯著降低(P＜0.05)，而M+EA、L+M、L+M+EA組大鼠左后足PWT D-value值無(wú)顯著變化(P＞ 0.05)。與M組比較，L+M、L+M+EA組大鼠左后足PWT D-value值顯著增加(P＜0.01)。如圖2B所示，Carr首次左后足注射后，與空白組比較，其余各組大鼠右后足PWT D-value值無(wú)顯著改變，而Carr二次右后足注射后1 d，與C組比較，M組、EA組、L+M組大鼠右后足PWT D-value值顯著降低(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05)。表明早期電針干預(yù)可明顯抑制疼痛記憶模型大鼠的疼痛感覺(jué)。

圖1 MT損毀位置及代表切片示意圖圖左半側(cè)為MT損毀后大鼠大腦冠狀切片尼氏染色結(jié)果，其中白色箭頭表MT損毀后確切區(qū)域；圖右半側(cè)為參照Paxinos等[11]的大鼠大腦圖譜（第六版）繪制的前囟后2.76 mm (Bregma -2.76 mm)的冠狀切片圖，灰色區(qū)域表MT核團(tuán)確切位置，▲表L+M組大鼠（10只）右側(cè)MT損毀位置，●表L+M+EA組大鼠（11只）右側(cè)MT損毀位置Fig.1 Location of lesion of the MT and representative schematic diagram The left half of the figure shows the results of Nissl staining of coronal slices of rats’ brain after MT lesion,and the exact location of MT lesion is marked with white arrows.The right half of the figure is a coronal section of 2.76 mm posterior to bregma (Bregma-2.76 mm) according to the atlas of Paxinos and Watson(sixth edition),the gray area presents the exact location of the MT,▲ indicates the location of lesion of the MT in L+M group rats (10 rats),● represents the location of lesion of the MT in L+M+EA group rats (11 rats).

圖2 各組大鼠左后足(A)與右后足(B) PWT D-value值比較(±SEM)*P＜0.05，**P＜0.01，與C組同期比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與M組同期比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與M+EA組同期比較Fig.2 Comparison of left hindpaw (A) and right hindpaw (B) of PWT D-value among all groups (±SEM)*P＜0.05,**P＜0.01,compared with group C;△P＜0.05,△△P＜0.01,compared with group M; #P＜0.05,##P＜0.01,compared with group M+EA.

3.各組大鼠CPA檢驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示，在Carr首次左后足注射后1 d，5 d，13 d，CPA score值均為負(fù)值，各組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)；而在Carr二次右后足注射后1 d，與C組比較，M組、L+M組大鼠CPA score值明顯降低(P＜0.01)。Carr二次注射后可誘導(dǎo)M、L+M組大鼠疼痛厭惡性情緒，MT損毀后未抑制疼痛厭惡性情緒的產(chǎn)生。

4.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，圖4A、4B、4C分別為各組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、總運(yùn)動(dòng)距離。與M組、L+M組大鼠同期比較，M+EA組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離均有增多趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P＞ 0.05)，L+M+EA組中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著增多(P＜0.05)；與M+EA組、L+M組比較，L+M+EA組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離均顯著增多(P＜0.05,P＜0.01)；與C組同期比較，M組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離顯著下降(P＜0.01)，而L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離均顯著增加(P＜0.01)；與M組同期比較，M+EA組、L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離均顯著增多(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)；與M+EA組同期比較，L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離均明顯增加(P＜0.01)，而L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Carr二次右后足注射可誘導(dǎo)疼痛記憶模型大鼠焦慮樣情緒的產(chǎn)生，且MT損毀未抑制疼痛記憶模型大鼠焦慮樣情緒的出現(xiàn)。

圖3 各組大鼠在Carr注射后各時(shí)間點(diǎn)的CPA score值的比較(±SEM)**P ＜0.01，與C組同期比較；△△P ＜0.01，與M組同期比較；※※P ＜0.01，與M+EA組同期比較；##P ＜0.01，與L+M組同期比較Fig.3 Comparison of CPA scores at various time points after Carr first injection of all group (±SEM)**P ＜0.01,compared with group C; △△P ＜0.01,compared with group M; ※※P ＜0.01,compared with group M+EA; ##P ＜0.01,compared with group L+M.

圖4 各組大鼠在左后足Carr首次注射后15 d曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間(4A)、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離(4B)、總運(yùn)動(dòng)距離(4C)的比較(±SEM)4A：△P＜0.05，與M組同期比較；#P＜0.05，與L+M組同期比較；4B：△△P＜0.01，與M組同期比較；※P＜0.05，與M+EA組同期比較；##P＜0.01，與L+M組同期比較；4C：**P＜0.01，與C組同期比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與M組同期比較；※※P＜0.01，與M+EA組同期比較；##P＜0.01，與L+M組同期比較Fig.4 In an Open Field test,the travelled distance (4B) and the time spent in centre zone (4A),total travelled distance in the whole arena (4C) among 5 groups the 15th day after Carr first injection on left hindpaw were compared (±SEM)4A:△P＜0.05,compared with group M; #P＜0.05,compared with group L+M.4B: △△P＜0.01,compared with group M; ※P＜0.05,compared with group M+EA,##P＜0.01,compared with group L+M.4C: **P＜0.01,compared with group C; △P＜0.05,△P＜0.01,compared with group M; ※※P＜0.01,compared with group M+EA; ##P＜0.01,compared with group L+M.

討 論

疼痛經(jīng)歷可被疼痛強(qiáng)度和疼痛不愉快感喚醒，臨床上疼痛記憶的產(chǎn)生大多由于疼痛的繼發(fā)性誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)性研究中有關(guān)疼痛記憶模型的制備方法有很多，在本實(shí)驗(yàn)中采用的是經(jīng)典的疼痛記憶模型制備方法，即Carr二次對(duì)側(cè)足注射，也是模仿臨床上疼痛的繼發(fā)性誘導(dǎo)。在疼痛研究領(lǐng)域中，疼痛的定義經(jīng)歷了由原來(lái)只包括疼痛感覺(jué)到“并不止于疼痛感覺(jué)”的演變，其還包括疼痛情緒等其他維度，因此本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法主要從疼痛感覺(jué)和疼痛情緒兩個(gè)方面闡述。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠雙側(cè)MT損毀后，制備疼痛記憶模型大鼠，在此期間分別運(yùn)用足底PWT檢測(cè)、CPA、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雙側(cè)MT損毀后的疼痛記憶模型大鼠的疼痛感覺(jué)、疼痛誘發(fā)情緒及電針干預(yù)效應(yīng)。采用動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀檢測(cè)得到PWT D-value值來(lái)評(píng)估Carr二次右后足注射后誘導(dǎo)的繼發(fā)性痛覺(jué)過(guò)敏是否喚醒了左后足的疼痛感覺(jué)記憶，CPA檢測(cè)得到的CPA score值反應(yīng)的是疼痛誘發(fā)厭惡性情緒變化情況，而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)大鼠焦慮樣情緒及運(yùn)動(dòng)能力的經(jīng)典檢測(cè)方法之一，其分析數(shù)據(jù)包括大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域時(shí)間、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、總運(yùn)動(dòng)距離等。

電針是目前臨床上緩解疼痛的主要治療方法之一，大量臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明其通過(guò)作用于中樞神經(jīng)環(huán)路而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，可明顯抑制炎性痛、神經(jīng)病理性痛、癌性痛等多種急慢性疼痛的疼痛感覺(jué)及炎性痛痛情緒。近年來(lái)，大量基礎(chǔ)研究結(jié)果示電針對(duì)疼痛誘發(fā)的情緒改變療效顯著，如Yan等[12]研究表明電針通過(guò)作用于慢性神經(jīng)病理性痛模型大鼠杏仁核中μ阿片受體而影響大鼠的痛感覺(jué)和情緒；弱刺激手針緩解神經(jīng)病理性鏡像痛大鼠負(fù)性情緒的機(jī)制可能與抑制ACC中小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化相關(guān)[13]；本課題組前期研究結(jié)果示2/100 Hz電針頻率對(duì)疼痛記憶的喚醒有抑制作用，且早期電針干預(yù)比晚期電針預(yù)處理對(duì)緩解疼痛記憶的產(chǎn)生具有更顯著的干預(yù)療效[14]，因此本次研究主要延續(xù)前期研究成果，采用2/100 Hz頻率早期電針干預(yù)。我們的初始假說(shuō)認(rèn)為MT損毀后，Carr首次左后足注射誘導(dǎo)大鼠急性炎性痛后其疼痛感受及疼痛厭惡性情緒均會(huì)隨之減弱，Carr二次對(duì)側(cè)足注射后其疼痛記憶及疼痛誘發(fā)情緒將不會(huì)被喚醒。值得關(guān)注的是，Carr二次右后足注射后，M組大鼠左后足PWT D-value值顯著降低，而L+M、L+M+EA組大鼠左后足PWT D-value值仍較高，此兩組大鼠在Carr二次注射后左后足未出現(xiàn)疼痛感覺(jué)記憶喚醒現(xiàn)象，提示雙側(cè)MT損毀后，影響了疼痛記憶模型大鼠的疼痛感覺(jué)記憶喚醒過(guò)程。筆者認(rèn)為其中可能原因：Carr足底注射，大鼠足底傷害性感受顯著增加，表現(xiàn)為機(jī)械縮足閾顯著降低，而疼痛記憶現(xiàn)象是一個(gè)長(zhǎng)期的學(xué)習(xí)記憶的高級(jí)認(rèn)知過(guò)程，需要經(jīng)雙側(cè)MT之間將外周傷害性感受信息進(jìn)行交換、整合并傳遞至皮層[15]，而雙側(cè)MT損毀后，阻斷了雙側(cè)MT之間進(jìn)行信息交流、整合并傳至更高級(jí)疼痛感受處理加工的核團(tuán)，因此Carr二次右后足注射后大鼠左后足疼痛感覺(jué)記憶將不再被喚醒。

與初始假說(shuō)相反的是，CPA檢測(cè)結(jié)果示L+M組大鼠在Carr二次對(duì)側(cè)足注射后CPA score值顯著降低，與M組、L+M組大鼠比較，M+EA組、L+M+EA組MT損毀后的疼痛記憶模型大鼠CPA score值顯著增加，MT損毀后的大鼠仍產(chǎn)生了對(duì)條件箱的回避行為，提示MT損毀后的疼痛記憶模型大鼠疼痛記憶被喚醒，而早期電針干預(yù)抑制了疼痛記憶模型大鼠厭惡性情緒；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與C組比較，M、L+M組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間減少，而電針干預(yù)后，與模型組比較，M+EA組、L+M+EA組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、總運(yùn)動(dòng)距離均增加，提示早期電針干預(yù)可有效緩解疼痛記憶模型大鼠焦慮樣情緒的產(chǎn)生。與M+EA組同期比較，L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離均明顯增加(P＜0.01)，而L+M組、L+M+EA組大鼠總運(yùn)動(dòng)距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MT損毀后的疼痛記憶模型大鼠活動(dòng)能力在一定程度有所增加?？傊?，雙側(cè)MT損毀后，并未對(duì)疼痛記憶模型大鼠誘發(fā)的厭惡性情緒形成及改變過(guò)程產(chǎn)生一定抑制作用，也不會(huì)減弱或消除Carr二次注射后產(chǎn)生的厭惡性情緒的記憶，MT可能不在疼痛記憶模型大鼠疼痛誘發(fā)情緒及中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且電針對(duì)誘發(fā)情緒的干預(yù)過(guò)程可能不是通過(guò)MT這一核團(tuán)實(shí)現(xiàn)。

針對(duì)此研究結(jié)果，做出以下推測(cè)：第一，Carr先后兩次注射誘導(dǎo)的疼痛記憶模型大鼠的疼痛誘發(fā)情緒，關(guān)于外周至中樞的神經(jīng)傳導(dǎo)通路中，脊髓-杏仁核或脊髓-ACC神經(jīng)環(huán)路的作用可能比脊髓-MT通路的作用更顯著、更重要。例如，Bushnell等[16]在1989年研究證明脊髓-丘腦通路投射到邊緣系統(tǒng)中的各個(gè)結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為在痛情緒的加工過(guò)程中發(fā)揮作用；Seok等[17]研究表明內(nèi)側(cè)隔核在內(nèi)側(cè)隔核-杏仁核或內(nèi)側(cè)隔核-海馬神經(jīng)環(huán)路中作為一中結(jié)點(diǎn)核團(tuán)而在傷害性刺激誘導(dǎo)的情緒變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。第二，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，也有研究表明MT在疼痛情緒信息的傳遞與參與作用是有限的，如：Wang等[18]研究表明MT不參與內(nèi)臟疼痛負(fù)面情緒的加工過(guò)程；Jurik等[19]運(yùn)用化學(xué)遺傳將內(nèi)側(cè)丘腦室旁核特異性抑制后改變了內(nèi)臟疼痛行為，而未見(jiàn)其對(duì)痛情緒行為的影響。Wilson等[20]的研究表明，在福爾馬林誘導(dǎo)的急性炎性痛模型中，MT損毀并未誘導(dǎo)大鼠的厭惡性情緒減弱或消失，MT在編碼疼痛強(qiáng)度和痛情緒維度的作用是有限的，他們推測(cè)其中的原因可能是MT的損毀中斷了MT與前扣帶皮層(anterior cingulate cortex,ACC)之間的連接，而ACC是邊緣系統(tǒng)不可分割的一部分，是處理痛情緒的核心，它對(duì)疼痛的感知、疼痛不愉快感的認(rèn)知和評(píng)估非常重要[21]。MT-ACC通路的連接中斷，可能加強(qiáng)了其他核團(tuán)與ACC之間的二級(jí)連接，以補(bǔ)償來(lái)自MT的傷害性信息輸入缺失。本實(shí)驗(yàn)中MT損毀后在Carr先后交叉注射后誘導(dǎo)疼痛記憶模型，疼痛誘發(fā)情緒仍然發(fā)生，可能也與該研究中推測(cè)原因一致。ACC是參與情緒調(diào)控的終極核團(tuán)，而MT只是作為傷害性信息加工并將疼痛感覺(jué)、疼痛情緒進(jìn)行整合及傳遞至皮層的中繼核團(tuán)。如果MT損毀，那么傳遞至MT這樣一個(gè)信息整合中樞的信息將被迫中斷，外周傷害性信息還是可能會(huì)通過(guò)其他調(diào)控通路而傳至ACC，并產(chǎn)生相應(yīng)情緒改變。第三，內(nèi)側(cè)丘腦中包括8～12個(gè)不同核團(tuán)，這些核團(tuán)的大小、傳入傳出連接及神經(jīng)化學(xué)特性方面各有不同[20]，這也使得它們?cè)谔弁凑{(diào)節(jié)過(guò)程中表現(xiàn)出獨(dú)特的作用，這些單個(gè)核團(tuán)尺寸大小不一、位置各有不同，因此為成功精確損毀操作過(guò)程提供了一定難度。此外，不同研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)不同行為學(xué)檢測(cè)方法探討MT在疼痛加工過(guò)程中的作用，且定義MT損毀位置也有不同的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，如Munn等研究表明丘腦束旁核(PF)內(nèi)注射嗎啡明顯抑制了由尾部電擊-發(fā)聲范式誘發(fā)的恐懼反應(yīng)[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，MT損毀位置嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)是背內(nèi)側(cè)丘腦（MDM和MDM）、背內(nèi)側(cè)中央丘腦(MDC)、丘腦中央核（PL和PC），那么除此之外的MT中其他核團(tuán)之間的相互連接是否對(duì)疼痛記憶模型大鼠疼痛誘發(fā)情緒產(chǎn)生代償調(diào)節(jié)作用還有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明MT損毀后明顯影響了疼痛記憶模型大鼠的疼痛感覺(jué)但不對(duì)疼痛誘發(fā)情緒產(chǎn)生作用，MT在疼痛記憶模型大鼠的疼痛誘發(fā)情緒可能不發(fā)揮關(guān)鍵作用，早期電針干預(yù)可明顯緩解MT損毀后疼痛記憶模型大鼠疼痛感覺(jué)及疼痛誘發(fā)情緒改變，而電針對(duì)疼痛記憶模型大鼠疼痛誘發(fā)情緒的干預(yù)機(jī)制可能不是通過(guò)MT這一核團(tuán)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)也存在未設(shè)計(jì)假手術(shù)組，未檢測(cè)MT損毀后的疼痛記憶模型大鼠的熱痛閾值的不足，將在以后研究中補(bǔ)充這些不足，也將對(duì)MT中特異性核團(tuán)與疼痛情緒相關(guān)的核團(tuán)之間的相互連接是否對(duì)痛記憶模型大鼠疼痛誘發(fā)情緒產(chǎn)生代償調(diào)節(jié)作用做進(jìn)一步探討。