劉文靜

摘 要 在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，污染問(wèn)題的存在會(huì)對(duì)培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響，并造成不同程度的科研、生產(chǎn)損失?；诖?，對(duì)植物組織培養(yǎng)期間常見(jiàn)的污染類型進(jìn)行分析研究，并提出科學(xué)的防控技術(shù)。

關(guān)鍵詞 常見(jiàn)污染類型;植物;組織培養(yǎng);污染防控

中圖分類號(hào)：S359 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.36.061

植物組織培養(yǎng)，是指借助細(xì)胞全能性特點(diǎn)，在人工配置培養(yǎng)基中采取無(wú)菌操作對(duì)植物的外植體進(jìn)行接種，然后利用人工控制的方式模擬植物生長(zhǎng)環(huán)境，以此實(shí)現(xiàn)離體培養(yǎng)的一種方法與技術(shù)。隨著植物組織培養(yǎng)科研力度的不斷加大，現(xiàn)階段遺傳改良、種質(zhì)保存以及植物快繁等領(lǐng)域都涉及到對(duì)植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用。而當(dāng)前植物組織培養(yǎng)的開(kāi)展，雖然在培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)操作等方面均按照無(wú)菌要求標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展，但是植物組織污染現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，不僅影響到實(shí)驗(yàn)成本和效果，甚至對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)造成影響。因此，進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的深入研究分析，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 植物組織培養(yǎng)常見(jiàn)污染類型

植物組織培養(yǎng)污染是指植物組織培養(yǎng)過(guò)程中因培養(yǎng)材料因素或外界微生物的侵染，使得植物組織和培養(yǎng)基滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)最終以失敗而告終。當(dāng)前植物組織培養(yǎng)中的常見(jiàn)污染具體分為病毒、真菌以及細(xì)菌污染。

1.1 細(xì)菌污染

作為龐大數(shù)量的微生物群，細(xì)菌充斥在我們的生活環(huán)境中，空氣、泥土、水源中都分布著大量的細(xì)菌，且不同細(xì)菌的大小、形態(tài)存在一定差異。植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)細(xì)菌污染，主要表現(xiàn)為植物材料表面或者是培養(yǎng)基表面產(chǎn)生黏液狀物體或渾濁水跡狀，有時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出泡沫發(fā)酵狀。通常情況下，植物材料在接種后1～2 d就能發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染[1]。細(xì)菌污染的主要產(chǎn)生因素在于實(shí)驗(yàn)人員接種期間對(duì)接種材料以及接種工具使用不當(dāng)，其中，芽孢桿菌與葡萄球菌是常見(jiàn)的細(xì)菌污染種類。

1.2 真菌污染

真菌喜好潮濕、溫度高的環(huán)境，若植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)真菌污染，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)毛絨狀、絮狀菌斑，并產(chǎn)生不同顏色孢子。真菌污染多在植物材料接種2～3 d可以發(fā)現(xiàn)，會(huì)形成較大面積的菌落，產(chǎn)生多顏色的絨毛狀菌斑，并且會(huì)散發(fā)出霉味。真菌污染的產(chǎn)生因素在于接種期間的環(huán)境問(wèn)題，常見(jiàn)真菌污染種類包括青霉菌、黑曲霉菌、芽枝霉菌、酵母菌等[2]。

1.3 病毒污染

病毒常以顆粒形式存在，體積非常小，并且病毒污染的概率也相對(duì)較小。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，病毒的污染僅憑肉眼觀察是難以發(fā)現(xiàn)的，需要借助電子顯微鏡來(lái)具體觀察[3]。病毒多在細(xì)胞內(nèi)潛伏，并且不會(huì)導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞壞死。植物組織培養(yǎng)期間產(chǎn)生病毒污染的主要因素是外植體。

2 植物組織培養(yǎng)常見(jiàn)污染防控技術(shù)

2.1 外植體污染消除

2.1.1 科學(xué)合理采集選擇外植體

要想避免因外植體對(duì)植物組織培養(yǎng)造成污染，需從源頭處進(jìn)行污染防控，所以應(yīng)注重對(duì)外植體的科學(xué)采集與選擇。在不同環(huán)境下，外植體攜帶細(xì)菌的程度存在一定差異，一般針對(duì)脫毒植物應(yīng)采用分生組織進(jìn)行培養(yǎng)，以降低污染發(fā)生率[4]。而對(duì)于采集時(shí)間的控制，應(yīng)盡可能在春季采集外植體，并在晴天中午開(kāi)展采集作業(yè)。當(dāng)然，外植體采集環(huán)境最好選擇在室內(nèi)，或者是采集新生嫩芽，因?yàn)榇杭疚廴境潭认鄬?duì)較低，而且晴天環(huán)境污染程度小于下雨天，室內(nèi)植物攜帶的細(xì)菌少于室外植株。此外，需注意采集前必須用75%酒精對(duì)工具、用具以及人員手部進(jìn)行消毒，降低污染發(fā)生率。

2.1.2 科學(xué)預(yù)培養(yǎng)外植體

若外植體采集為室外采集，并檢測(cè)出外植體污染嚴(yán)重，則可以利用室內(nèi)盆栽的方式來(lái)降低污染程度，可采用珍珠巖、蛭石種植，并結(jié)合施加抗生素來(lái)降低污染程度[5]。需要注意，應(yīng)控制外植體生長(zhǎng)，禁止在室內(nèi)盆栽中施加肥料，合理控制外植體生長(zhǎng)溫度、濕度以及光照。等到外植體抽出新芽后，結(jié)合細(xì)菌病毒檢測(cè)結(jié)果選擇是否將其新芽當(dāng)作外植體。若植株無(wú)法進(jìn)行室內(nèi)盆栽，則可以利用塑料袋覆蓋，等到植株抽出新芽后，選擇合適外植體。

2.1.3 細(xì)致清潔、消毒外植體

等到外植體確定完畢，應(yīng)開(kāi)展高效的外植體清潔消毒工作，在盡可能減少對(duì)外植體傷害的基礎(chǔ)上，確保其攜帶的微生物被徹底消毒滅殺。在具體清潔消毒過(guò)程中，先將外植體表面的泥土污垢用清水沖洗掉，然后進(jìn)行剪枝，接著將外植體放入燒杯中用洗潔精水浸泡

3 min，之后將其放置于流水狀態(tài)下沖洗30 min，最后在無(wú)菌操作臺(tái)中用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗后再用0.1%升汞浸泡10～30 min。需要注意，在清潔消毒期間應(yīng)合理應(yīng)用與選擇消毒劑，避免消毒劑對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用[6]。

2.2 環(huán)境污染防控

2.2.1 熏蒸消毒技術(shù)

在開(kāi)展植物組織培養(yǎng)前，應(yīng)結(jié)合具體情況開(kāi)展熏蒸處理，合理配置熏蒸液，具體包括高錳酸鉀3～6 g·m-3、甲醛4～6 mL·m-3。熏蒸前，應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室的門(mén)窗關(guān)閉，然后將事前調(diào)配好的甲醛溶液倒入高錳酸鉀溶液中，此時(shí)因化學(xué)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量煙霧，工作人員必須立即避開(kāi)煙霧，避免對(duì)人體造成傷害。等到熏蒸時(shí)間達(dá)到30 min后，即可停止熏蒸。在植物組織培養(yǎng)期間應(yīng)保持每月一次的頻率開(kāi)展熏蒸消毒。

2.2.2 紫外燈照射消毒技術(shù)

應(yīng)及時(shí)清理污染培養(yǎng)基、污染物品，保持培養(yǎng)室中清潔干凈，并且保持培養(yǎng)架干凈且無(wú)雜物。與此同時(shí)，利用次氯酸鈉消毒液對(duì)接種室和培養(yǎng)室進(jìn)行定期消毒。每次接種前用75%酒精噴灑室內(nèi)促使灰塵降落，然后用紫外燈照射30 min，以此起到消毒的作用。

2.2.3 設(shè)備消毒

針對(duì)接種室、培養(yǎng)室內(nèi)工作人員每天接觸的工具、用具必須提前進(jìn)行消毒處理，而無(wú)菌操作臺(tái)必須在使用前進(jìn)行30 min的紫外燈照射，并且對(duì)操作臺(tái)上各個(gè)操作面用75%酒精進(jìn)行細(xì)致擦拭。操作臺(tái)的過(guò)濾網(wǎng)需要每月一換，切不可在操作臺(tái)中隨意堆放物品。需要注意，若操作臺(tái)長(zhǎng)期未使用，必須在使用前徹底清潔消毒，并對(duì)操作臺(tái)的滅菌效果進(jìn)行檢測(cè)。若滅菌效果不理想，會(huì)直接影響到培養(yǎng)結(jié)果，所以必須嚴(yán)格按照規(guī)定進(jìn)行滅菌。

2.3 操作污染管理

2.3.1 人員衛(wèi)生控制

植物組織培養(yǎng)操作人員應(yīng)保持衛(wèi)生，必須在工作期間定期修剪指甲并勤洗手。在無(wú)菌操作區(qū)域，禁止佩戴任何首飾，禁止吸煙、喝水、聽(tīng)音樂(lè)、進(jìn)食。工作服僅能在無(wú)菌環(huán)境內(nèi)穿著，禁止帶出無(wú)菌室。定期進(jìn)行更衣室的清潔消毒，工作服需保持至少每7 d 1次的清潔消毒次數(shù)。工作人員在進(jìn)入無(wú)菌環(huán)境前，必須用肥皂或洗手液進(jìn)行手部清潔，等到穿衣完畢后，再次用消毒液進(jìn)行手部清潔，進(jìn)而降低外植體受污染的概率[7]。

2.3.2 嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程

在植物組織培養(yǎng)期間，操作不當(dāng)也極易導(dǎo)致污染問(wèn)題出現(xiàn)。所以，在具體操作期間，必須嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定要求。1）配制室。培養(yǎng)基必須在培養(yǎng)作業(yè)開(kāi)展的前2天配制完畢;要定期對(duì)天平、pH計(jì)、溫度計(jì)進(jìn)行檢查;針對(duì)化學(xué)藥品的保存，必須保持其存儲(chǔ)環(huán)境溫度在4 ℃;對(duì)高壓滅菌鍋等設(shè)備的使用，必須按照規(guī)定要求進(jìn)行。2）培養(yǎng)室。培養(yǎng)室的光照、溫度和濕度必須按照規(guī)定要求合理調(diào)整，并對(duì)室內(nèi)溫度、濕度、光照定時(shí)記錄。若溫度、濕度過(guò)高或過(guò)低，應(yīng)及時(shí)采取合理措施進(jìn)行調(diào)整，避免對(duì)外植體的生長(zhǎng)造成影響。3）操作室。接種前，操作室必須用紫外燈照射30 min，并定期開(kāi)展地面消毒工作，同時(shí)，工作人員需對(duì)操作臺(tái)的清潔度進(jìn)行定期檢測(cè)，嚴(yán)格控制工具、用具的滅菌時(shí)間。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著我國(guó)科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。而要想最大化實(shí)現(xiàn)植物組培技術(shù)的作用與價(jià)值，就需對(duì)當(dāng)前植物組培常見(jiàn)污染進(jìn)行深入分析，結(jié)合科學(xué)的污染防控技術(shù)來(lái)降低植物組織培養(yǎng)期間出現(xiàn)污染的概率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 任目瑾，周建峰.植物組織培養(yǎng)的常見(jiàn)污染及其防控技術(shù)[J].陜西林業(yè)科技，2016（6）：103-105.

[2] 彭立群，田子珩，張俊琦.植物組培中污染發(fā)生原因及防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣東林業(yè)科技，2012，28（1）：82-86.

[3] 葉添謀.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的常見(jiàn)技術(shù)難題研究進(jìn)展[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（3）：84-90.

[4] 邵龍珠，趙淑君，王淑榮，等.植物組織培養(yǎng)中的常見(jiàn)問(wèn)題與解決技術(shù)措施[J].林業(yè)勘查設(shè)計(jì)，2012（1）：49-51.

[5] 潘娟，李先源，李名楊.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：2392-2394.

[6] 趙春莉，李金英.植物組織培養(yǎng)中污染原因及其控制方法[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，35（6）：11-13.

[7] 周權(quán)男，姜澤海，李哲，等.植物組織培養(yǎng)中污染控制技術(shù)的研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，32（9）：53-56.

（責(zé)任編輯：趙中正）