任 東

(西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

1 引 言

腐殖酸(HA)是一類(lèi)組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜、物理上不均勻的有機(jī)混合物，主要來(lái)源于動(dòng)植物殘?bào)w的生物化學(xué)分解過(guò)程，廣泛分布于沉積物、沼澤、湖泊、河流及海洋等水生生態(tài)系統(tǒng)[1]。以碳含量計(jì)，HA在自然水體中的含量常為0.5～100 mgC/L[2-3]，可占水體總?cè)芙庑杂袡C(jī)質(zhì)的40%～80%[4]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，HA本身是一種生物難利用的混合物，但其結(jié)構(gòu)組成易被光化學(xué)、氧化還原、絡(luò)合和溶解-沉淀等作用所改變。HA對(duì)波長(zhǎng)小于600nm的太陽(yáng)光具有強(qiáng)烈的吸收，其光化學(xué)過(guò)程通常會(huì)對(duì)水體中各物理、化學(xué)和生物過(guò)程產(chǎn)生重要的影響[5]，如加速碳、氮等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)，為異養(yǎng)型微生物提供生長(zhǎng)所需的能源和營(yíng)養(yǎng)元素，以及為植物生長(zhǎng)提供必要微量元素等。

在太陽(yáng)光照射下，水體中溶解性有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均會(huì)發(fā)生大幅度改變，并生成甲酸、乙酸、丁二酸等小分子有機(jī)物[6-7]，其本身生物可利用性也可能會(huì)發(fā)生顯著變化，這將對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量循環(huán)產(chǎn)生極為重要的影響。然而，HA等有機(jī)質(zhì)的生物可利用性受光照條件的影響至今未形成共識(shí)。Bittar等對(duì)藻源有機(jī)質(zhì)生物可利用性受光照的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示光照能顯著降低該類(lèi)有機(jī)質(zhì)的生物可利用性[8]；然而，Senga等在研究陸源有機(jī)質(zhì)生物可利用性受光照條件影響時(shí)卻得到了完全相反的結(jié)論，并且他們指出光照對(duì)有機(jī)質(zhì)生物可利用性的改變可能與其來(lái)源有關(guān)[9]。同時(shí)，微生物是水生生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)碳各種生物地球化學(xué)過(guò)程中最具活力的參與者，其活動(dòng)過(guò)程能顯著利用或改變有機(jī)碳的種類(lèi)、組成和性質(zhì)。因此，本文擬以稻田土壤微生物為受試生物，對(duì)光照影響溶解性HA的生物可利用性進(jìn)行深入探究，從而為溶解性HA的生物地球化學(xué)行為與效應(yīng)研究提供基礎(chǔ)信息。

2 材料與方法

2.1 樣品采集及預(yù)處理

稻田土壤樣品采集自四川蒼溪(E 105°58′46″、N 31°42′47″，2017年10月)，均為5cm以下的土壤部分。手工剔除動(dòng)植物殘?bào)w后，一部分新鮮土壤用于微生物接種液制備，另一部分土壤風(fēng)干后避光保存，用于腐殖酸提取。

2.2 微生物接種液及HA制備

將新鮮土壤于室溫下活化3天，按10∶1(v/w)比例加入去離子水振蕩混勻，靜置過(guò)夜后離心獲取上清液，將其稀釋至溶解性有機(jī)碳濃度低于儀器檢測(cè)限，即獲得微生物接種液。

按前期研究建立的方法提取HA，并制備HA儲(chǔ)備液和工作液[10]，獲得的HA固體和溶液均避光保存于4°C下。

2.3 腐殖酸光照實(shí)驗(yàn)

配制濃度為200.0mgC/L的HA工作液，調(diào)節(jié)pH=7.5±0.2后于光化學(xué)反應(yīng)儀上進(jìn)行光照。實(shí)驗(yàn)溫度為25.0±0.5°C，并保持各反應(yīng)器與空氣相通。于0、8、16、24和48小時(shí)取樣，分別標(biāo)記為HA0、HA8、HA16、HA24和HA48。將獲得的部分HA樣品進(jìn)行冷凍干燥，剩余部分于4°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 生物可利用性實(shí)驗(yàn)

配制微生物生長(zhǎng)基質(zhì)溶液，每升溶液中礦物鹽的含量如下：100.0mg K2HPO4·12H2O、100.0mg KH2PO4、40.0mg NaCl、50.0mg NH4Cl、100.0mg MgSO4和50.0mg CaCl2·2H2O。采用滅菌的基質(zhì)溶液配制微生物生長(zhǎng)液，使HA濃度為20.0mgC/L，并向各生長(zhǎng)液加入500μL微生物接種液。接種好的反應(yīng)體系于好氧黑暗條件下培養(yǎng)72h，并于設(shè)定時(shí)刻下測(cè)定各培養(yǎng)體系光密度。

2.5 測(cè)試表征與數(shù)據(jù)分析

光照前后，HA濃度由總有機(jī)碳分析儀測(cè)定、吸光特性采用紫外-可見(jiàn)(UV-vis)分光光度計(jì)測(cè)試(測(cè)試HA濃度為5.0mgC/L)、組成和結(jié)構(gòu)變化由元素分析和紅外光譜確定，HA生物可利用性高低由微生物生長(zhǎng)量(培養(yǎng)液光密度，OD680)指示。

3 結(jié)果與討論

3.1 HA光學(xué)特性變化

如圖1所示，隨光照時(shí)間增加，HA的UV-vis吸光能力逐漸減小，這可能是由HA光礦化及其光吸收官能團(tuán)破壞導(dǎo)致。為了驗(yàn)證這一猜想，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了HA溶液TOC隨光照時(shí)間的變化，結(jié)果顯示光照并未引起HA溶液TOC的明顯變化。與HA0相比，HA48的TOC僅降低了3.6%。因此，光吸收官能團(tuán)受損是HA吸光能力減弱的主要原因，這與Sharpless等研究光氧化改變腐殖酸電化學(xué)特性時(shí)所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致[11]。

圖1 光照對(duì)HA吸光能力的影響Fig.1 Influence of light irradiation on HA absorbance

盡管不同光照程度HA的UV-vis吸收光譜十分相似，各HA吸光能力均隨波長(zhǎng)增大呈指數(shù)模式減小，但其吸收光譜特征指數(shù)能在一定程度上反映光照對(duì)HA的組成和結(jié)構(gòu)的改變情況。如表1所示，E2/E3值大小與HA結(jié)構(gòu)中的電子轉(zhuǎn)移復(fù)合結(jié)構(gòu)豐度密切相關(guān)，隨電子轉(zhuǎn)移復(fù)合結(jié)構(gòu)含量增加而減小[12]。因此，HA光吸收能力隨光照時(shí)長(zhǎng)增加而減小的變化趨勢(shì)也與其電子轉(zhuǎn)移復(fù)合體結(jié)構(gòu)受損程度相關(guān)[13]。光譜斜率(S275-295)、光譜斜率比(SR)及特征紫外吸收系數(shù)(SUVA254)均與HA的分子量大小和芳香度成反比[14-15]，因此光照導(dǎo)致了HA的芳香度和分子量減小。

表1 HA光吸收特征指數(shù)Tab.1 Light absorption characteristics of the HA

3.2 HA組成和結(jié)構(gòu)改變

為了進(jìn)一步確認(rèn)UV-vis吸收光譜所指示的HA組成及結(jié)構(gòu)變化，實(shí)驗(yàn)對(duì)各HA樣品進(jìn)行了元素組成分析。如表2所示，隨光照時(shí)長(zhǎng)增加，HA的碳元素含量比例有所增加，而氧元素含量比例有所減小，這與HA中羧酸組分光礦化過(guò)程相關(guān)[14]。原子比H/C隨光漂白過(guò)程有增大的趨勢(shì)，表明HA中芳香性組分相對(duì)含量減少，脂肪性組分相對(duì)含量增加。這與UV-vis光譜分析的結(jié)果相一致，即光照過(guò)程中HA的芳香性組分會(huì)不斷減少。原子比O/C和(O+N)/C隨光照過(guò)程呈現(xiàn)出先增大后減小的變化趨勢(shì)，這表明HA的極性先增大后減小，這些變化均與HA先被分解成有機(jī)酸然后被礦化的過(guò)程密切相關(guān)[7]。

表2 不同光照時(shí)長(zhǎng)HA的組成及原子比Tab.2 Composition and atomic ratios of HA under different light duration

圖2 不同光照時(shí)長(zhǎng)HA的FTIR光譜Fig.2 FTIR spectra of HA with different light duration

各HA樣品的FTIR表征結(jié)果如圖2所示。隨光照時(shí)長(zhǎng)增加，-OH響應(yīng)(3 400cm-1)不斷減弱，而-COOH響應(yīng)(1 662cm-1)呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，這可能是HA中氧元素比例隨光照時(shí)長(zhǎng)增加先增大后減小的原因。同時(shí)，這些官能團(tuán)響應(yīng)也與Polak等對(duì)溶解性HS紅外光譜分析結(jié)果一致[16]。與H/C值變化趨勢(shì)一致，-CH3和-CH2-響應(yīng)(1 450cm-1和1 372cm-1)也呈現(xiàn)出不斷增強(qiáng)的變化趨勢(shì)。因此，隨光照時(shí)間增加，HA組成中會(huì)累積脂肪類(lèi)物質(zhì)，其生物可利用性可能會(huì)有所增加。

3.3 光照對(duì)HA生物可利用性的改變

如圖3所示，原始HA幾乎不能為微生物生長(zhǎng)提供條件，培養(yǎng)前后溶液TOC僅減小了8.5%左右，但光照能顯著增加HA溶液的微生物可利用性(p<0.05)，其TOC減小了31%～52%不等。相應(yīng)地，HA0-微生物體系的光密度無(wú)顯著變化(p>0.05)，而光照HA-微生物培養(yǎng)體系的光密度增大了1.38～2.05倍。盡管前期研究指出，光化學(xué)反應(yīng)會(huì)與微生物生長(zhǎng)過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)溶解性有機(jī)質(zhì)中的碳源物質(zhì)[17]，但HA光分解的同時(shí)也會(huì)生成微生物不穩(wěn)定性碳，而這部分有機(jī)碳能為微生物生長(zhǎng)提供有利條件。因此，與HA0相比，微生物能在光照HA溶液中良好生長(zhǎng)。

圖3 不同HA-微生物培養(yǎng)體系的光密度及TOC含量Fig.3 Optical density and TOC contents of different HA-microbe incubation systems

各光照HA中，HA16具有最高的生物可利用性，這與各HA元素組成及官能團(tuán)變化趨勢(shì)基本一致。盡管HA8具有最高的氧含量，但其碳含量相對(duì)較低，因此其生物可利用性低于HA16，這與Goldstone等的研究結(jié)論一致，即光分解腐殖質(zhì)產(chǎn)生的有機(jī)酸并不是微生物生長(zhǎng)的主要碳源[7]。因此，光照HA產(chǎn)生的脂肪性有機(jī)碳是其生物可利用性增大的主要原因。微生物培養(yǎng)后的原始HA和光照HA的UV-vis光譜分析結(jié)果如圖4所示，與圖1相比可知，對(duì)長(zhǎng)波光敏感的HA組分也是微生物生長(zhǎng)優(yōu)先利用的有機(jī)物組分。因此，生物可利用性從HA16開(kāi)始下降的主要原因是生物可利用性有機(jī)碳發(fā)生了光化學(xué)降解。

圖4 各HA微生物培養(yǎng)后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.4 UV-vis absorption spectra of various HA microorganisms after culture

4 結(jié) 論

4.1 光照過(guò)程中，HA主要生成了小分子有機(jī)物，包括脂肪性有機(jī)物和有機(jī)酸等，僅小部分發(fā)生了光礦化過(guò)程；同時(shí)，HA的腐殖化程度和芳香化程度隨光照時(shí)長(zhǎng)增加逐漸減小，氧元素比重先增大后減小，而碳元素比重先減小后增大。

4.2 光化學(xué)轉(zhuǎn)化能顯著增加HA的微生物可利用性，生成的小分子脂肪性有機(jī)物是光照增強(qiáng)HA生物可利用性的主要原因，但HA中對(duì)長(zhǎng)波光敏感的組分也是微生物生長(zhǎng)優(yōu)先利用的部分，因此光照對(duì)HA微生物可利用的增強(qiáng)作用與光照時(shí)長(zhǎng)相關(guān)。