駱婕 郭妹 吳瑾柔 陶瑩

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2病理科（廣州510080）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMS）是子宮內(nèi)膜組織在子宮體以外的部位出現(xiàn)并生長，簡稱內(nèi)異癥，主要以下腹痛、痛經(jīng)和不孕為主要癥狀，在育齡期婦女中發(fā)病率為10%［1］。EMS是一種良性疾病，但具有浸潤、增殖、轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為［2］。盡管關(guān)于EMS的研究較多，但異位子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)移和浸潤的相關(guān)病理生理機(jī)制至今仍未闡明。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子-1（metastasisassociated in colon cancer-1，MACC1）是肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和C-met信號通路中met基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸癌、胃癌等惡性腫瘤的組織中表達(dá)增強(qiáng)，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。目前，有關(guān)MACC1及其參與的HGF/C-Met信號通路在EMS方面的研究尚未公開報(bào)道。本研究通過檢測MACC1，HGF及其受體C-met蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)，探討其與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系及機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年7月至2017年12月在廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科行腹腔鏡檢查診斷子宮內(nèi)膜異位癥40例，按照ASRM進(jìn)行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期9例，Ⅳ期13例，分別取異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織（增生期）；同期因輸卵管性不孕行宮腹腔鏡聯(lián)合檢查術(shù)（腹腔鏡排除EMS）患者的子宮內(nèi)膜活檢組織20例為對照組（增生期）。觀察組年齡26～44歲，平均（34.70±3.84）歲，對照組年齡段為27～38歲，平均（33.50±2.89）歲，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.232，P=0.223）。本研究通過倫理委員會審查且所有研究標(biāo)本的收集均取得患者的同意，并重新給予病理閱片。

1.2 主要儀器和試劑蛋白電泳儀（美國BioRad公司）；兔抗人MACC1多克隆抗體（美國Sigma公司）、兔抗人HGF、C-met多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），鼠抗人β-actin單克隆抗體（上?？党缮锟萍加邢薰荆?；ECL試劑盒（武漢艾捷科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法（Westernblot） 用蛋白裂解液收集并提取組織總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量測定，加入10%SDS-PAGE電泳，蛋白樣品濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，4 ℃下分別用MACC1、HGF、C-met、β-actin（內(nèi)參）孵育過夜，室溫下二抗孵育2 h，ECL試劑反應(yīng)后曝光，圖像掃描后采用Image Pro Plus 6.0軟件用比較分析特異性蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)汁學(xué)軟件包SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性采用spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACC1、HGF和C?met蛋白在不同內(nèi)膜中的表達(dá)在不同內(nèi)膜組織中，MACC1、HGF和C-met蛋白表達(dá)呈現(xiàn)異位內(nèi)膜＞在位內(nèi)膜＞對照組內(nèi)膜兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1、圖1）。

表1 MACC1、HGF和C-met蛋白在各組中的表達(dá)Tab.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues x±s

表1 MACC1、HGF和C-met蛋白在各組中的表達(dá)Tab.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues x±s

例數(shù)40 40 20組織異位內(nèi)膜在位內(nèi)膜對照組內(nèi)膜F值P值MACC1 0.65±0.14 0.34±0.12 0.03±0.01 195.02＜0.05 HGF 0.86±0.09 0.43±0.08 0.10±0.03 704.05＜0.05 C-met 0.71±0.14 0.42±0.05 0.09±0.03 269.07＜0.05

圖1 MACC1、HGF和C-met蛋白在不同內(nèi)膜組織中的表達(dá)（western blot）Fig.1 Expressions of MACC1 HGF and C-met proteins in different endometrial tissues（western blot）

2.2 EMS中，MACC1、HGF和C?met蛋白表達(dá)相關(guān)性經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥中MACC1蛋白的異常高表達(dá)與HGF和C-met蛋白的異常高表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.750，P=0.000；r=0.539，P=0.000），HGF蛋白與C-met蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.647，P=0.000）。見圖2。

2.3 EMS不同ARSM分期中MACC1、HGF和C?met蛋白分別在在位內(nèi)膜組及異位內(nèi)膜組中的表達(dá)在EMS的在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組中，MACC1、HGF和C-met蛋白的表達(dá)在Ⅰ期與Ⅱ期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但Ⅲ期中表達(dá)較Ⅰ/Ⅱ期明顯升高，Ⅳ期中的表達(dá)較Ⅲ期更高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

圖2 MACC1與HGF和C-met蛋白的表達(dá)的相關(guān)性分析Fig.2 The correlation analysis among MACC1 HGF and C-met protein

表2 MACC1、HGF和C-met蛋白在EMS不同分期中的表達(dá)Tab.2 The Expression of MACC1，HGF and C-met proteins in different stages of EMS x±s

表2 MACC1、HGF和C-met蛋白在EMS不同分期中的表達(dá)Tab.2 The Expression of MACC1，HGF and C-met proteins in different stages of EMS x±s

在位內(nèi)膜組異位內(nèi)膜組例數(shù)6 12 9 13 ARSM分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F值P值MACC1 0.23±0.06 0.24±0.05 0.35±0.02 0.48±0.08 38.36＜0.05 HGF 0.35±0.09 0.37±0.04 0.44±0.02 0.51±0.05 23.49＜0.05 C-met 0.37±0.05 0.38±0.03 0.43±0.01 0.48±0.03 33.12＜0.05 MACC1 0.52±0.12 0.55±0.07 0.67±0.03 0.79±0.09 25.19＜0.05 HGF 0.79±0.05 0.79±0.04 0.86±0.01 0.96±0.07 31.78＜0.05 C-met 0.59±0.12 0.59±0.11 0.72±0.04 0.86±0.05 28.86＜0.05

MACC1位于人類第七號染色體（7p21.1），2009年由STEIN學(xué)者在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)并命名，參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，與疾病的轉(zhuǎn)移進(jìn)展密切相關(guān)［4］。近年來，多項(xiàng)研究顯示，MACC1不僅是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)指標(biāo)，也與胃癌、肺癌等多種組織來源的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5-6］。隨著研究的不斷深入，MACC1還被證實(shí)與子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤有相關(guān)性，MACC1的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性［7-8］。本研究是通過Western blot檢測MACC1蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，來了解其與EMS的相關(guān)性。結(jié)果表明，MACC1在EMS的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的表達(dá)均明顯高于對照組內(nèi)膜，且異位內(nèi)膜的表達(dá)較在位內(nèi)膜更高，說明MACC1與EMS存在相關(guān)性。MACC1可能通過增強(qiáng)內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、種植的能力參與EMS的發(fā)生和發(fā)展。

HGF是一種多功能細(xì)胞活性因子，須與其受體C-met相結(jié)合方能發(fā)揮作用，兩者結(jié)合導(dǎo)致兩個酪氨酸殘端在羧基端的磷酸化，引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的酶促反應(yīng)［9］?？烧T導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)動、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲性生長，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［10］。正常的HGF/C-met通路可調(diào)節(jié)和促進(jìn)組織的損傷和修復(fù)，具有積極的作用，而異常激活后則能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。既往研究已證實(shí)，HGF/C-met信號通路在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，并且與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［11-12］。EMS雖為良性疾病，但其內(nèi)膜細(xì)胞具有惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，具有較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，本研究結(jié)果顯示HGF及其受體C-met蛋白在EMS異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于對照組內(nèi)膜，且異位內(nèi)膜中表達(dá)高于在位內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明HGF/C-met信號通路參與EMS發(fā)生的可能性，由于子宮內(nèi)膜異位癥中的在位內(nèi)膜細(xì)胞較正常內(nèi)膜細(xì)胞更活躍，在HGF/C-met信號通路的參與及作用下，在位內(nèi)膜細(xì)胞獲得更強(qiáng)的增殖、侵襲能力，從而促進(jìn)在位內(nèi)膜細(xì)胞向盆腔及其他組織種植及轉(zhuǎn)移，形成子宮內(nèi)膜異位病灶而發(fā)病。由于MACC1、HGF/C-met蛋白在異位內(nèi)膜表達(dá)較在位內(nèi)膜更高，說明異位內(nèi)膜細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移游走后獲得了更強(qiáng)的增殖及侵襲能力，使子宮內(nèi)膜異位癥疾病呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的臨床表現(xiàn)。另一方面，筆者通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜組織中，MACC1與HGF、C-met蛋白的表達(dá)均存在正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)了MACC1、HGF和C-met可能協(xié)同參與EMS的發(fā)生及發(fā)展。而相關(guān)研究已經(jīng)表明MACC1是HGF/C-met信號通路的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，且C-met已被證明是MACC1的轉(zhuǎn)錄子靶點(diǎn)［13］。因此，MACC1是通過調(diào)控HGF/C-met信號通路，從而參與EMS的發(fā)生及發(fā)展。

EMS的分期方法有多種，但目前國內(nèi)常采用“修正EMS分期法”（ASRM），對腹腔鏡探查手術(shù)的患者，根據(jù)術(shù)中異位病灶的部位、數(shù)目、大小、粘連程度等進(jìn)行評分及分期，因此該分期方法可以較為客觀的反映疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后。本研究通過分析EMS不同ASRM分期中，MACC1、HGF和C-met蛋白分別在異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的表達(dá)情況，了解其與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示隨著EMS分期的升高，MACC1、HGF、C-met蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)同步升高的趨勢，僅在I期與II期之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明MACC1及HGF/C-met蛋白的高表達(dá)與EMS疾病的分期及預(yù)后密切相關(guān)。反之，抑制MACC1基因的表達(dá)，可能通過負(fù)調(diào)控HGF/C-met信號通路，從而抑制EMS疾病的發(fā)展，這又給筆者下一步的研究帶來新的思路。

綜上所述，MACC1、HGF和C-met可能協(xié)同參與EMS的發(fā)生及發(fā)展，且與疾病的臨床預(yù)后密切相關(guān)。MACC1可能通過調(diào)控HGF/C-met信號通路參與EMS的發(fā)病。但是，由于研究對象及研究條件的局限性，筆者需要通過擴(kuò)大樣本量及更深入的分子學(xué)水平研究來證實(shí)這種推測的可能性，將來是否可以通過抑制MACC1的表達(dá)來抑制EMS的疾病的發(fā)展還需要進(jìn)一步的研究來推進(jìn)。