代景瑩，鄒孟穎，楊 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黃曉兵，王曉冬

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，四川 成都 610072)

慢性髓細(xì)胞白血病(CML)在酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)時(shí)代其療效已得到了革命性的提高[1～3]。但目前仍有一部分患者不可避免地發(fā)生疾病進(jìn)展[4，5]，是否可以從免疫學(xué)的角度，通過(guò)可行的相關(guān)免疫指標(biāo)對(duì)患者的抗腫瘤免疫力進(jìn)行監(jiān)測(cè)及評(píng)估，從而指導(dǎo)療效預(yù)測(cè)并及時(shí)調(diào)整治療方案以減少疾病進(jìn)展，這是一個(gè)需要進(jìn)一步研究的有前景的方向。本研究對(duì)CML患者進(jìn)行了T細(xì)胞亞群免疫指標(biāo)的檢測(cè)，以期探討T細(xì)胞亞群中各指標(biāo)的特點(diǎn)是否可對(duì)CML患者臨床緩解程度、療效預(yù)測(cè)起到一定指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料2002年9月30日至2018年9月30日我院血液內(nèi)科就診并確診為CML慢性期的104例患者，均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、及分子生物學(xué)檢查確診，符合國(guó)內(nèi)統(tǒng)一的診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2T細(xì)胞亞群的檢測(cè)采集患者外周血進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)T細(xì)胞亞群，包括CD8+T細(xì)胞比例(CD8+T/Lymphocyte)，CD4+T細(xì)胞亞群Th1細(xì)胞比例(Th1/ CD4+T)，Th2細(xì)胞比例(Th2/CD4+T)，Treg細(xì)胞比例(Treg/CD4+T)等。采用BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，所需免疫熒光抗體-熒光素標(biāo)記的抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、 IFN-γ、IL-4抗體均購(gòu)自BD公司、熒光素標(biāo)記的抗Foxp3抗體購(gòu)自eBioscience公司。染色過(guò)程：①Th1比例和Th2比例：全血+1640混勻，然后加入刺激劑(包括布雷非德菌素A，佛波酯，離子霉素)在孵箱培養(yǎng)4 h；取出后，加入相應(yīng)標(biāo)記的抗體，如抗CD3抗體，抗CD8抗體，混勻，室溫孵育20 min；加入10X紅細(xì)胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震蕩，室溫10 min，PBS液洗后，加入相應(yīng)的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，各加入IFN-γ抗體和IL-4抗體，孵育20 min；PBS洗1遍，加入適量 PBS重懸待上機(jī)檢測(cè)。備注：Th細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3+CD4+，而當(dāng)用PMA刺激4小時(shí)時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)CD4+的細(xì)胞明顯減少，甚至消失，這是因?yàn)镻MA會(huì)誘發(fā)細(xì)胞表面CD4分子被內(nèi)吞。所以本研究、亦是通常的做法是用CD3和CD8反設(shè)CD4細(xì)胞，即CD3+CD8-的細(xì)胞被認(rèn)為是CD3+CD4+的細(xì)胞。②Treg比例：全血+1640混勻，然后加入相應(yīng)標(biāo)記的抗體，如抗CD3抗體，抗CD4抗體，抗CD25抗體，混勻，室溫孵育20 min；加入10X紅細(xì)胞裂解液，震蕩，室溫10 min，PBS液洗后加入相應(yīng)的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，加入Foxp3抗體，孵育20 min；PBS洗1遍，加適量PBS液重懸待上機(jī)檢測(cè)。③CD8+T比例：紅細(xì)胞裂解液裂紅處理15～20 分鐘，離心，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的抗CD45抗體、抗CD3抗體、抗CD8抗體避光4 ℃孵育20 分鐘，PBS液洗后離心，重懸于適量PBS液待上機(jī)檢測(cè)。其后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析采用Diva 流式數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行。

1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)治療反應(yīng)定義及療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參照2013版中國(guó)慢性髓系白血病診斷與治療指南。完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解(CCyR)定義為Ph+細(xì)胞為0。主要分子學(xué)緩解(MMR)定義為BCR-ABLIS≤0.1%。主要分子學(xué)緩解4.5(MR4.5)定義為BCR-ABLIS≤0.0032%。Th1/CD4+T比例引用海斯特檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的正常參考范圍11.8%～25.8%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用方差分析及LSD法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者臨床特征將104例患者按照臨床疾病緩解狀態(tài)分為未緩解組(未達(dá)到CCyR，包括血液學(xué)未緩解及血液學(xué)緩解但未達(dá)到CCyR)(n=24)，CCyR組(n=13)，MR4.5組(n=67)，臨床疾病緩解狀態(tài)評(píng)估均按照患者進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測(cè)當(dāng)日的臨床狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。未緩解組2例伴附加染色體異常，其余102例均不伴隨附加染色體異常。104例患者中，男性占64.42%，女性占35.58%。中位年齡45歲(16～78歲)，發(fā)病年齡主要集中在33～56歲。未緩解組男性占75%，女性占25%，中位年齡32.5歲(16～75歲)；CCyR組男性占76.92%，女性占23.08%，中位年齡64歲(25～70歲)；MR4.5組男性占58.21%，女性占41.79%，中位年齡46歲(17～78歲)。

2.23組四種T細(xì)胞亞群情況62.50%的未緩解組患者、15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者表現(xiàn)出Th1比例(Th1/CD4+T)低于正常參考范圍。未緩解組Th1降低率高于CCyR組和MR4.5組，Th1比例值低于CCyR組和MR4.5組(P< 0.05)，CCyR組與MR4.5組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。三組Treg比例(Treg/CD4+T)、Th2比例(Th2/CD4+T)、CD8+T比例(CD8+T/Lymphocyte)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組四種T細(xì)胞亞群情況比較 (%)

*與CCyR組和MR4.5組比較，P< 0.05

3 討論

隨著對(duì)腫瘤免疫的認(rèn)識(shí)逐漸深入，對(duì)腫瘤患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)顯得越來(lái)越重要，其對(duì)于療效預(yù)測(cè)及預(yù)后評(píng)估有著重要意義。慢性粒細(xì)胞白血病在TKI時(shí)代其療效已得到顯著改善，但仍有一部分患者不可避免地出現(xiàn)耐藥、療效不佳，以及發(fā)生疾病進(jìn)展。對(duì)CML患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)與評(píng)估，對(duì)于治療方案的指導(dǎo)、療效的預(yù)測(cè)以及預(yù)后的評(píng)估可能起著重要指導(dǎo)意義。但以什么免疫指標(biāo)作為理想的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，以有效評(píng)估免疫狀況及指導(dǎo)診療目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，仍需進(jìn)一步研究、探討。而T細(xì)胞為抗腫瘤免疫中重要的免疫細(xì)胞，目前認(rèn)為細(xì)胞免疫應(yīng)答模式為主要的抗腫瘤免疫應(yīng)答模式，而其中CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群中的Th1細(xì)胞為主導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的T細(xì)胞亞群[6]。由此，對(duì)CD8+T細(xì)胞及Th1細(xì)胞的監(jiān)測(cè)對(duì)評(píng)估CML患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫力可能有著重要指導(dǎo)意義。而CD4+T細(xì)胞作為主導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答類(lèi)型的轉(zhuǎn)化方向的重要輔助性T細(xì)胞，其還包括了主導(dǎo)體液免疫應(yīng)答模式的Th2亞群，主導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17亞群，以及主導(dǎo)免疫應(yīng)答的負(fù)向調(diào)控的Treg亞群[7]，而Treg細(xì)胞在體內(nèi)的水平一定程度上可反映體內(nèi)免疫應(yīng)答受抑制的程度[8]，Th2等其它亞群在體內(nèi)的水平可從一定角度上反映體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答的模式是否為主導(dǎo)地位。由此本中心著眼于CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞亞群的監(jiān)測(cè)，以期其可有助于對(duì)CML患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫力進(jìn)行評(píng)估，并可進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療、療效預(yù)測(cè)、與預(yù)后評(píng)估。

本研究結(jié)果顯示，62.50%的未緩解組患者Th1比例值低于正常下限，而只有15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者表現(xiàn)出Th1比例值低于正常下限，而未緩解組Th1實(shí)際平均值亦低于CCyR組及MR4.5組。Th1水平的降低，可導(dǎo)致體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的降低，此可進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的增漲與臨床緩解狀態(tài)的不理想。而Th1水平的升高，可促進(jìn)體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答的活化，而其中的效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞可進(jìn)一步執(zhí)行有效識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞的任務(wù)，從而可進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷的降低與良好的臨床緩解狀態(tài)(CCyR或MR4.5)。本研究結(jié)果提示，Th1有潛力成為一有意義的免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)以對(duì)療效預(yù)測(cè)起到一定指導(dǎo)意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于CML患者Th1水平的相關(guān)研究尚較少，但已有研究報(bào)道，新診斷CML患者及慢性期CML患者的Th1水平顯著低于健康對(duì)照組，提示Th1為一潛在的治療靶點(diǎn)以及能為治療帶來(lái)更好的療效獲益，這在研究結(jié)論上與本研究一定程度上呈一致[9]。

除此之外，本研究亦對(duì)各組的Treg水平、Th2水平及CD8+T細(xì)胞水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)上述3種T細(xì)胞亞群在未緩解組、CCyR組與MR4.5組中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Treg一定程度上反映了體內(nèi)免疫應(yīng)答受抑制的程度，由本研究結(jié)果可見(jiàn)，在三組不同臨床緩解狀態(tài)的所致因素中，Treg水平可能并非起主導(dǎo)作用的因素。而Th2細(xì)胞為體內(nèi)主導(dǎo)體液免疫應(yīng)答模式的輔助性T細(xì)胞亞群，目前認(rèn)為抗腫瘤免疫主要由細(xì)胞免疫應(yīng)答模式介導(dǎo)，本研究結(jié)果提示三組患者中Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答模式并非起主導(dǎo)地位，在導(dǎo)致三組不同臨床緩解狀態(tài)的所致因素中，Th2水平亦非起主導(dǎo)作用的因素。CD8+T細(xì)胞為執(zhí)行細(xì)胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)性T細(xì)胞，Th1水平的升高會(huì)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化增殖。本研究中，三組間未觀察到CD8+T比例(CD8+T/Lym)的顯著差異，原因可能有以下幾方面：①本研究中對(duì)CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞數(shù)目占淋巴細(xì)胞數(shù)目的比例，而Th1為淋巴細(xì)胞的一部分，由于Th1水平顯著上升，由此上升的CD8+T在CD8+T/Lymphocyte比例上的變化表現(xiàn)得不顯著。②CD8+T細(xì)胞總數(shù)作為檢測(cè)指標(biāo)不能全面地反映抗CML特異性T細(xì)胞的水平。三組不同緩解狀態(tài)下的患者體內(nèi)是否存在抗CML特異性CD8+T水平的差異，而導(dǎo)致臨床緩解狀態(tài)的不同，本研究中并未進(jìn)行深入、具體的研究?？笴ML特異性CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)原理及方法較復(fù)雜，并需要較高的成本，由此在作為對(duì)CML患者長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的免疫指標(biāo)角度上考慮，抗CML特異性CD8+T細(xì)胞是否為一理想免疫監(jiān)測(cè)指標(biāo)尚難以確定。

綜上，本研究結(jié)果提示，不同臨床緩解狀態(tài)下的CML患者T細(xì)胞亞群特點(diǎn)中，Th1水平為一有顯著性意義的指標(biāo)，Th1水平與臨床緩解狀態(tài)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。Th1水平有望成為一長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的理想免疫指標(biāo)，從一定角度上協(xié)助評(píng)估患者的抗腫瘤免疫力，同時(shí)可在CML患者的療效預(yù)測(cè)上起到一定指導(dǎo)意義，并可對(duì)緩解狀態(tài)不理想的患者及時(shí)指導(dǎo)調(diào)整治療方案以減少疾病進(jìn)展。