魏文波，杜 宇

(樂山市武警四川總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 樂山 614000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，細(xì)胞癌變起源于骨髓中的漿細(xì)胞。由于淋巴細(xì)胞出現(xiàn)免疫功能異常，致使細(xì)胞監(jiān)視功能缺陷，免疫系統(tǒng)對(duì)于惡變的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清除的能力下降，從而發(fā)生并發(fā)展為MM[1]。MM患者的免疫系統(tǒng)存在復(fù)雜的缺陷，包含DC、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等多個(gè)方面，這些方面可能共同參與了惡變的腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制[2，3]。MM患者的生存期差異較大，尋找腫瘤臨床預(yù)后因素的工作難度較大。MM常并發(fā)高鈣血癥、腎臟損害及貧血等，由于患者正常免疫球蛋白的生成受到抑制，容易出現(xiàn)細(xì)菌性感染[4]。本研究探討免疫功能缺陷與MM危險(xiǎn)分層以及臨床預(yù)后因素的關(guān)系，為進(jìn)一步研究MM的發(fā)病機(jī)制以及免疫治療方案提供參考。

1 資料及方法

1.1一般資料2016年4月到2018年3月我院收治的32例MM患者，年齡46～77歲[(53.14±5.48)歲]，患者均為初診；采用國(guó)際分期系統(tǒng)(DS)進(jìn)行疾病分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，行淋巴細(xì)胞表型分析后發(fā)現(xiàn)患者未出現(xiàn)活動(dòng)性感染?；熀蠡颊卟∏橛?4例處于穩(wěn)定期，8例進(jìn)展期，將患者按照年齡分組，45～60歲18例為一組，61歲以上14例為二組。32例患者與104例健康獻(xiàn)血者進(jìn)行對(duì)比，一組62例，二組42例。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]①患者骨髓中漿細(xì)胞增多數(shù)量>30%；②骨髓漿細(xì)胞異常增生10%～30%，活檢證實(shí)為漿細(xì)胞腫瘤；③M蛋白過度產(chǎn)生，尿本周蛋白成分>1 g/24 h；血清IgA>20 g/L，IgG>35 g/L；④正常免疫球蛋白減少，IgA<1 g/L，IgG<6 g/L，IgM<0.5 g/L。

1.3分期標(biāo)準(zhǔn)[6]①Ⅰ期患者骨髓瘤細(xì)胞總數(shù)<0.6×1012/m2，血鈣正常，骨骼X射線結(jié)果正常，或者呈現(xiàn)孤立性溶骨病變，血紅蛋白>100 g/L，M蛋白IgA<30 g/L 、IgG<30 g/L；②Ⅱ期患者骨髓瘤細(xì)胞總數(shù)<(0.6～1.2)×1012/m2，；③Ⅲ期患者骨髓瘤細(xì)胞總數(shù)>1.2×1012/m2，血鈣>2.99 mmol/L，骨骼X射線呈現(xiàn)進(jìn)行性溶骨病變，血紅蛋白<85 g/L，M蛋白IgA>50 g/L 、IgG>65 g/L。

1.4研究方法①淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：使用流式細(xì)胞儀對(duì)患者的淋巴細(xì)胞免疫表型進(jìn)行檢測(cè)，方法參照文獻(xiàn)[7]：取出兩組患者以及健康獻(xiàn)血員新鮮的抗凝血標(biāo)本各4 ml，用于血常規(guī)檢測(cè)2 ml，另2 ml用于流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Bioscience生產(chǎn)，型號(hào)BD FACSEALIBUR)進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記測(cè)驗(yàn)。檢測(cè)過程中使用的單克隆抗體組成為：FITC-IgG1/PE-IgG1/PEcy5-IgG1、FITC-CD3/PE-CD16/PEcy5-CD19、FITC-CD3/PE-CD8/PEcy5-CD4、FITC-CD28/PE-CD81/PEcy5-CD4等。取標(biāo)本中各100 μl放入指定樣品測(cè)定管內(nèi)，并加入相應(yīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體，振蕩混勻、避光孵育，室溫下靜置20分鐘后加入500 μl溶血素，同樣振蕩混勻、避光孵育，室溫下靜置8分鐘。溶血完成后，在測(cè)定管內(nèi)加入2 ml磷酸緩沖液，沖洗兩遍后加入1 ml磷酸緩沖液混勻后上機(jī)檢驗(yàn)。②脊髓染色體熒光原位雜交檢測(cè)：采用熒光原位雜交技術(shù)來進(jìn)行檢測(cè)，方法參照文獻(xiàn)[8]：取兩組患者新鮮的抗凝骨髓液標(biāo)本各4 ml，從中提取單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行低滲、固定處理，于-80 ℃環(huán)境中保存。雜交檢測(cè)前一天滴片，室溫下老化，第二天放置顯微鏡下觀察，劃定雜交范圍。檢測(cè)5種細(xì)胞的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，包含1q21擴(kuò)增、D13 s319缺失、RB1缺失、P53缺失以及IGH易位。細(xì)胞遺傳學(xué)異常陽(yáng)性：異常信號(hào)>10%。③血清β2-MG的檢測(cè)：采集MM患者空腹外周血5 ml，采用免疫比濁法檢測(cè)血清β2-MG水平，儀器為OLYMPUS AU2700型的全自動(dòng)生化分析儀。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布計(jì)量資料比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Person直線相關(guān)法。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MM患者淋巴細(xì)胞亞群分析與對(duì)照組比較，不同年齡段的兩組患者CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比明顯升高(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比明顯降低(P< 0.05)。見表1。

2.2細(xì)胞遺傳學(xué)異常對(duì)MM患者淋巴細(xì)胞亞群的影響32例MM患者中有28例進(jìn)行了脊髓染色體熒光原位雜交檢測(cè)，本研究將高危遺傳學(xué)改變定義為1q21擴(kuò)增呈現(xiàn)陽(yáng)性，P53缺失陽(yáng)性及3個(gè)以上的染色體異常。將28例患者劃分為高危細(xì)胞遺傳學(xué)(FISH高危組)與無(wú)高危細(xì)胞遺傳學(xué)(FISH無(wú)高危組)，分別為13例、15例。兩組T淋巴細(xì)胞比例及絕對(duì)值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。FISH高危組CD8+細(xì)胞比例、CD8+HLADR+/CD8+細(xì)胞比例明顯高于FISH無(wú)高危組，CD4+CD28+/CD4+百分?jǐn)?shù)明顯低于FISH無(wú)高危組(P< 0.05)。見表2。

2.3MM患者淋巴細(xì)胞亞群與β2-MG的關(guān)系CD8+細(xì)胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比與血清β2-MG水平呈正相關(guān)(P< 0.05)，CD4+CD28+/CD4+百分比與β2-MG呈負(fù)相關(guān)(P< 0.05)，見表3。

表1 兩組MM患者淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果

表2 熒光原位雜交技術(shù)不同程度分層亞組患者的淋巴細(xì)胞亞群比較

表3 MM患者淋巴細(xì)胞亞群與生化指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

MM是一種源自B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞疾病，作為B淋巴細(xì)胞發(fā)育到最終階段的細(xì)胞，MM病癥可以歸類在B淋巴細(xì)胞的范圍之中[9，10]。MM臨床上主要表現(xiàn)為骨髓漿細(xì)胞的異常增生，伴有單克隆免疫球蛋白或者M(jìn)蛋白過度產(chǎn)生。MM患者除了體液免疫功能缺陷外，細(xì)胞免疫功能也存在諸多異常[10～12]。T細(xì)胞在人體內(nèi)不斷更新，同一時(shí)間中能夠存在不同的發(fā)育階段或者功能，其中可將T細(xì)胞分為若干亞群，主要有：①輔助性T細(xì)胞，如Th(CD4+)細(xì)胞，主要能夠輔助體液免疫、細(xì)胞免疫；②抑制性T細(xì)胞，如Ts細(xì)胞(CD3+/CD8+)，能夠抑制細(xì)胞免疫、體液免疫；③效應(yīng)T細(xì)胞，能夠釋放淋巴因子功能；④記憶T細(xì)胞，如CD4+細(xì)胞記憶亞群，能夠記憶特異性抗原刺激等等。

有研究對(duì)MM患者淋巴細(xì)胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)MM患者體內(nèi)B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及T細(xì)胞水平異常，由于年齡是影響MM患者生存期的危險(xiǎn)因素，研究發(fā)現(xiàn)年齡>60歲患者中位生存時(shí)間顯著短于年齡≤60歲患者[13]，所以本研究根據(jù)患者年齡分為45～60歲組和60歲以上組，并對(duì)兩組與健康對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，45～60歲組CD4+細(xì)胞百分比顯著升高，CD8+細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化，CD4/CD8比值明顯升高，60歲以上組CD4+細(xì)胞百分比、CD4/CD8比值均無(wú)明顯變化，CD8+細(xì)胞百分比明顯升高，與之前研究結(jié)果不一致[14]。原因可能在與T細(xì)胞亞群構(gòu)成復(fù)雜有關(guān)。CD4+T細(xì)胞可分為作用完全相反的不同亞群，如CD4+Th1和Th2細(xì)胞可使機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，而Tregs細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫功能具有抑制作用，同樣CD8+T細(xì)胞也可分為抑制性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，所以對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞總體情況進(jìn)行分析意義不大，需進(jìn)一步細(xì)化分析。

CD4+CD28+/CD4+細(xì)胞百分比可反映CD4+T細(xì)胞功能，因?yàn)橥庵苎猅細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子除了需要MHC的呈遞信號(hào)外，還需B7分子與T細(xì)胞上的CD28結(jié)合所提供的信號(hào)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)年齡組相對(duì)于對(duì)照組，CD4+CD28+/CD4+百分比均顯著降低，F(xiàn)ISH高危組相對(duì)于FISH無(wú)高危組，CD4+CD28+/CD4+百分比顯著降低，提示MM患者免疫功能存在異常，CD28表達(dá)減少，無(wú)法被抗原呈遞細(xì)胞激活產(chǎn)生細(xì)胞因子應(yīng)答清除腫瘤細(xì)胞，且與細(xì)胞遺傳學(xué)有關(guān)。CD8+T細(xì)胞主要包括CD3+CD4-CD8+CD28+細(xì)胞和CD3+CD4-CD8+CD28-細(xì)胞，CD3+CD4-CD8+CD28+細(xì)胞即殺傷性T細(xì)胞，是一類細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)病毒感染或帶有致敏抗原的腫瘤細(xì)胞具有特異殺滅作用。CD3+CD4-CD8+CD28-細(xì)胞即抑制性T細(xì)胞，通過抑制抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞活化，發(fā)揮體液和細(xì)胞免疫抑制作用。本研究對(duì)殺傷性T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組CD8+CD28+/CD8+百分比與對(duì)照組比較均無(wú)明顯變化，在FISH高危組和FISH無(wú)高危組之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MM患者殺傷性T細(xì)胞并未明顯升高，若有CD8+T淋巴細(xì)胞增殖推測(cè)與抑制性T細(xì)胞增多有關(guān)。另外，HLADR和CD38是CD8+T細(xì)胞活化的標(biāo)志性分子，本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康對(duì)照組，兩組CD8+HLADR+/CD8+百分比、CD8+CD38+/CD8+百分比均顯著升高，相對(duì)于FISH無(wú)高危組，F(xiàn)ISH高危組CD8+HLADR+/CD8+百分比顯著升高，提示CD8+T細(xì)胞功能異?；罨瘜?dǎo)致MM患者免疫功能下降，清除腫瘤細(xì)胞能力減弱，且與細(xì)胞遺傳學(xué)有關(guān)。

MM的預(yù)后因素包括年齡、血紅蛋白水平、肌酐水平β2-MG等，β2-MG水平能反映骨髓瘤細(xì)胞總量，是MM國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)的參考因素之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞、CD8+HLADR+/CD8+、CD4+CD28+/CD4+百分比與細(xì)胞遺傳學(xué)有關(guān)，所以進(jìn)一步通過Person直線相關(guān)性分析對(duì)三者與血清β2-MG水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞百分比、CD8+HLADR+/CD8+百分比與血清β2-MG水平呈正相關(guān)，CD4+CD28+/CD4+百分比與β2-MG呈負(fù)相關(guān)，說明T細(xì)胞的異常與MM預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，外周血CD4+T細(xì)胞功能缺陷、CD8+T淋巴細(xì)胞異常增生以及CD8+T細(xì)胞功能異常活化是造成MM患者免疫功能缺失的主要原因，且與患者細(xì)胞遺傳學(xué)危險(xiǎn)度分層之間存在一定的相關(guān)性。細(xì)胞遺傳學(xué)危險(xiǎn)度在一定程度上決定了患者預(yù)后情況，為進(jìn)一步確定免疫功能缺陷與MM預(yù)后的關(guān)系，本研究分析發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞、CD8+HLADR+/CD8+CD4+、CD28+/CD4+百分比均與預(yù)后因子血清β2-MG水平相關(guān)。所以以上三種細(xì)胞可能成為疾病預(yù)后的判斷指標(biāo)，值得臨床深入研究。