姚海淋，霍麗紅，郝云鵬，來永巍，段慧鑫，歐國芳，何紅鵬

(天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，從美國癌癥協(xié)會(ACS)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)分析，乳腺癌患者人數(shù)預計占所有新診斷癌癥患者的 1/2，乳腺癌已成為全球范圍內(nèi)危害女性身體健康的頭號殺手[2-3]．乳腺癌主要是由于乳腺上皮細胞在致癌因子的作用下發(fā)生基因突變，成為不受調(diào)控、可以無限增殖的癌細胞而導致的[4]．

以組蛋白為代表的蛋白質(zhì)乙酰化修飾是表觀遺傳學研究的重要內(nèi)容，通過乙酰化修飾改變蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和所帶電荷，從而增強或削弱蛋白質(zhì)的生物學功能[5]．乙酰化修飾是可逆的生物學反應，行使去乙酰化功能的組蛋白去乙?；?histone deacetylase complex，HDAC)更是臨床腫瘤抑制劑研發(fā)的熱點[6].通過抑制 HDAC活性，誘導組蛋白的適度乙酰化狀態(tài)，將高度有序的染色體打開，促進轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，從而使受抑的腫瘤抑制基因得到表達，起到治療腫瘤的作用[7]．

組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)通過抑制 HDAC 的活性而使組蛋白過乙酰化，進而通過抑制血管新生、細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性等作用而產(chǎn)生較強的抗腫瘤效應，因此在抗腫瘤方面有良好的應用前景．SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是繼HMBA(hexamethylene bisacetamide)之后的第二代氧肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿?HMBA具有更高的活性，在微摩爾(μmol/L)水平即對腫瘤細胞有很大的殺傷效果[8]．SAHA 是小相對分子質(zhì)量(＜300)線性肟酸，是廣譜組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可以抑制Ⅰ類和Ⅱ類 HDAC的活性，其作用機制為通過結(jié)合到酶的活性位點而抑制HDAC的活性[9-10]．

SAHA是目前研究最多、最深入的組蛋白去乙?；敢种苿?，在一些疾病的研究與治療中已有重要應用．多數(shù)研究認為 SAHA的抗腫瘤機制與上調(diào) p21基因表達有關(guān)：王箏等[8]研究表明SAHA可以通過促進 p21基因和 Bax基因的表達，能夠在體外抑制人卵巢癌SKOV3細胞的生長并促進其凋亡；于濤等[11]研究表明 SAHA可以誘導骨髓瘤細胞的凋亡，選擇性誘導細胞周期負調(diào)控子p21的表達，從而阻滯細胞周期，誘導多種腫瘤細胞的分化和凋亡．以往對SAHA抗腫瘤作用研究主要集中于其對細胞增殖和凋亡的影響．本研究用SAHA處理乳腺癌細胞，分別從細胞水平、蛋白水平以及 RNA分子水平上觀察SAHA對乳腺癌細胞遷移和增殖的影響．

1 材料與方法

1.1 細胞株和細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞 MCF-7、人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC細胞為本實驗室保藏．細胞用 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，添加 10%滅活胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代．

1.2 主要試劑

青鏈霉素，Gibco公司；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；GAPDH單克隆抗體、CyclinD1抗體、CDK4抗體、p21抗體，Santa公司；MYL9抗體，Abcam 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol 裂解液、RNA 酶抑制劑，Invitrogen 公司；Fast SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems公司；SAHA、DMSO，上海賽金生物科技公司．

1.3 細胞劃痕實驗

將 MCF-7細胞接種于 6孔板，培養(yǎng) 18～24h．在每孔中央用 10μL吸頭垂直劃兩條寬度為300～500μm的無細胞交叉劃痕區(qū)．用PBS清洗，加入含 1% FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)．將DMSO 溶液加入對照組中，將 SAHA 按照 2.5、5、10、20μmol/L的濃度加入實驗組中．每隔 12h在熒光倒置顯微鏡下觀察每孔中劃痕寬度變化情況，拍照并記錄劃痕寬度(愈合快慢)，愈合快慢代表 MCF-7細胞在培養(yǎng)板上遷移率大?。?/p>

1.4 Transwell實驗

按每孔約5×105個細胞鋪在24孔Transwell上層小室中，下室加含藥培養(yǎng)基(含 10% FBS)500～600μL；培養(yǎng) 16h后，將孔板取出，PBS洗 3次；用500～600μL含 4%多聚甲醛溶液固定小室下層細胞20min；PBS洗3次；500～600μL 100%甲醇放在24孔板中，小室浸在其中，室溫放置 20min；PBS洗 3次；吉姆薩染色，通過激光掃描共聚焦顯微鏡計數(shù)上、下、左、右、中這5個視野下的細胞數(shù)并拍照．

1.5 免疫印跡(Western blot)檢測

收集處理組及陰性對照組 MCF-7細胞，加入200μL SDS 細胞裂解液，4℃裂解20min，用細胞刮刀收集蛋白于1.5mL EP管中，煮沸5min，取蛋白進行SDS-PAGE電泳．電泳完畢，利用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上，用質(zhì)量分數(shù)為 5%的脫脂奶粉室溫封閉 1h，一抗于 4℃下孵育過夜．然后用 PBS 緩沖液(PBST)漂洗 NC膜 3次，每次5min．洗完后于室溫下二抗避光孵育 1h，PBST漂洗 3次，每次5min．洗完后，用 Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作對照．

1.6 細胞 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)

收集細胞，Trizol法提取總 RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進行實時熒光定量 PCR．在Invitrogen公司合成以下引物：GAPDH上、下游引物5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′和 5′-GCAGAA GGGGCGGAGATGA-3′，產(chǎn)物大小 213bp；p21 上、下游引物 5′-GACACCACTGGAGGG TGACT-3′和5′-CAGGTCCACATGGTCTTCCT-3′，產(chǎn) 物 大 小172bp；CyclinD1 上、下游引物 5′-GCTGCGAAGTG GAAACCATC-3′和 5′-CCTCCTTCTGCACACATT TGAA-3′，產(chǎn)物大小 135bp．

1.7 MTT實驗

收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，將其加入96孔板中，每孔加入 100μL，使待測細胞密度為1000～10000個/孔．過夜培養(yǎng)，加入濃度梯度的藥物，設(shè)置 3～5個復孔．孵育 24h，倒置顯微鏡下觀察．每孔加入 10μL MTT溶液(5mg/mL，即 0.5%MTT)，避光條件下進行，繼續(xù)培養(yǎng)4h．終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10min，使結(jié)晶物充分溶解．在酶聯(lián)免疫檢測儀 490nm 處測量各孔的吸光度(A)，按照式(2)計算存活率．

1.8 克隆形成實驗

將胰酶消化后的單個細胞以適當密度接種于 6孔板中，每孔接種 100～200個細胞進行培養(yǎng)．細胞貼壁后，將濃度梯度的藥物加入到 6孔板中．待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)．用PBS清洗3次．向每孔中加 4%的多聚甲醛，固定細胞 15min.去除固定液，加適量吉姆薩染色液染色 10～30min，然后用去離子水緩慢洗下染色液，將6孔板倒扣在濾紙上，干燥．再將 6孔板倒扣在一張白色的紙上，拍照并比較克隆數(shù)．

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)處理，與對照組相比進行顯著性分析：*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示 P＜0.001．

2 結(jié)果與分析

2.1 SAHA作為HDAC抑制劑的有效劑量范圍

為了確定SAHA發(fā)揮HDAC抑制劑作用的有效濃度，用 SAHA處理 MCF-7細胞，進行了免疫印跡實驗，檢測組蛋白的乙?；Y(jié)果如圖1所示．

圖1 SAHA阻斷組蛋白的去乙?；疐ig. 1 Histone deacetylation blocked by SAHA

由圖1可知：相對于對照組，當SAHA的濃度由2.5μmol/L增加到 20μmol/L時，組蛋白 H4的乙?；?acH4)是逐漸上調(diào)的．這表明組蛋白去乙酰化反應被阻斷，SAHA在此濃度范圍可以抑制HDAC活性，且具有濃度依賴性．

2.2 SAHA對乳腺癌細胞MCF-7遷移的影響

為了檢測SAHA對MCF-7細胞遷移的影響，進行了體外劃痕實驗與 Transwell實驗．以不加 SAHA的MCF-7細胞作為對照組，與對照組相比，加藥48h后，隨著SAHA濃度的升高，MCF-7細胞劃痕愈合明顯減慢(圖2)；Transwell實驗中，相對于加DMSO的對照組，加SAHA的實驗組MCF-7細胞的跨膜遷移的個數(shù)比較少(圖 3)．這表明 SAHA 對細胞的遷移具有抑制作用．

圖2 劃痕實驗檢測SAHA對MCF-7細胞遷移的影響Fig. 2 Wound healing assay to detect the effects of SAHA on the migration of MCF-7 cells

圖3 Transwell 實驗檢測 SAHA對 MCF-7細胞遷移的影響Fig. 3 Transwell assay to detect the effects of SAHA on the migration of MCF-7 cells

2.3 SAHA對MCF-7細胞遷移相關(guān)基因表達的影響

為了探索 SAHA抑制 MCF-7細胞遷移的分子機制，檢測了SAHA對MCF-7細胞中與遷移關(guān)系密切的MYL9基因表達的影響，如圖4所示．相對于對照組，加SAHA的實驗組的遷移相關(guān)基因 MYL9蛋白的表達量是逐漸下調(diào)的，這說明 SAHA可以抑制遷移相關(guān)基因蛋白的表達．

圖4 SAHA抑制遷移相關(guān)基因MYL9的表達Fig. 4 SAHA inhibiting the expression of MYL9

2.4 SAHA對乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響

為了檢測SAHA對MCF-7細胞增殖的影響，分別進行了 MTT實驗與克隆形成實驗(吉母薩染色，記錄克隆數(shù))．圖 5是驗證 SAHA對腫瘤 MCF-7細胞與非腫瘤HUVEC細胞存活影響的實驗．

圖5 MTT實驗檢測 SAHA對 MCF-7和 HUVEC細胞增殖的影響Fig. 5 MTT assay to detect the effects of SAHA on proliferation of MCF-7 and HUVEC cells

由圖 5可見：SAHA對MCF-7細胞的存活具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，MCF-7細胞的存活率逐漸降低．而對于 HUVEC細胞，只有在高濃度時，其存活率下調(diào)明顯．因此，這表明 SAHA可以抑制腫瘤 MCF-7細胞的存活，對非腫瘤細胞 HUVEC存活抑制不明顯．

圖6和圖7是SAHA對MCF-7與HUVEC細胞增殖影響的實驗．用 SAHA處理 MCF-7細胞時，當藥物濃度在 2.5μmol/L與 5μmol/L兩個較低的濃度時，形成的克隆數(shù)目就已經(jīng)很少，當濃度較高時，便已不能形成克隆，這說明SAHA可以抑制MCF-7細胞的增殖(圖 6)．而對于 HUVEC細胞，只有在高濃度時(20μmol/L)，其克隆形成數(shù)目下降明顯；在低濃度時，SAHA對HUVEC細胞的克隆形成數(shù)目影響不大(圖 7)．因此，這表明 SAHA 可以抑制 MCF-7細胞的增殖，且腫瘤細胞 MCF-7比非腫瘤細胞HUVEC對SAHA更加敏感．

圖6 克隆形成實驗檢測SAHA對MCF-7細胞增殖的影響Fig. 6 Colony forming assay to detect the effects of SAHA on proliferation of MCF-7 cells

圖7 克隆形成實驗檢測 SAHA對 HUVEC細胞增殖的影響Fig. 7 Colony forming assay to detect the effects of SAHA on proliferation of HUVEC cells

2.5 SAHA對乳腺癌細胞 MCF-7增殖相關(guān)基因表達的影響

為了檢測 SAHA對增殖相關(guān)基因 CyclinD1、CDK4與 p21的影響，運用實時熒光定量 PCR和免疫印跡方法從 mRNA和蛋白表達水平上進行了檢測，以加DMSO的為對照組，結(jié)果如圖8和圖9所示.

圖8 SAHA對增殖相關(guān)基因蛋白的影響Fig. 8 Effects of SAHA on the protein expression of cell proliferation related genes

圖9 SAHA對MCF-7細胞增殖相關(guān)基因RNA的影響Fig. 9 Effects of SAHA on the RNA expression of cell proliferation related genes

CyclinD1是細胞周期蛋白，CDK4是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶，而p21蛋白可以抑制CDK復合物活性．圖 8和圖 9結(jié)果表明：與對照組相比，加藥組的CyclinD1、CDK4在蛋白以及RNA的水平上表達量均下調(diào)，但 p21的表達量上調(diào)，并且蛋白的表達量變化隨藥物濃度的降低具有濃度梯度依賴性．由以上的結(jié)果說明：SAHA抑制了腫瘤 MCF-7細胞過度增殖相關(guān)基因的表達，促進了抑癌基因表達．

3 討 論

一般情況下，細胞中組蛋白的乙?；c去乙?；删S持動態(tài)平衡并受到嚴格調(diào)控，但當這種平衡被外界因素打破時，就常常會導致基因表達紊亂，進而引起疾病的發(fā)生，特別是容易引起腫瘤的發(fā)生[12]．在多種腫瘤發(fā)現(xiàn) HDAC過量表達，SAHA能夠通過抑制HDAC的活性而使組蛋白過乙酰化，進而通過細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡等作用機制而產(chǎn)生較強的抗腫瘤效應，因此在某些腫瘤治療方面展現(xiàn)了良好的應用前景[13]，但 SAHA對乳腺癌細胞遷移和增殖的影響及機制未見報道．

蛋白質(zhì)乙?；揎椣嚓P(guān)的表觀遺傳學改變是造成腫瘤發(fā)生的一個很重要的因素，而高遷移，異常增殖是腫瘤細胞的標志，本研究使用小分子化合物SAHA處理細胞，分別從乳腺癌細胞 MCF-7的遷移和增殖角度，闡述其抗乳腺癌作用機制，最終發(fā)現(xiàn)SAHA在分子水平上抑制促增殖和遷移相關(guān)基因、增強抑增殖基因表達；在細胞水平上，可以抑制 MCF-7的遷移與增殖，具有顯著的抗乳腺癌作用．本研究對乳腺癌新藥研發(fā)具有一定的意義．