王彥力，白 雪，多立安，趙樹(shù)蘭

（天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

碳納米材料（石墨烯、氧化石墨烯和碳納米管）由于其獨(dú)特的物理性質(zhì)，在高靈敏度傳感器制造、生物成像、藥物輸送和環(huán)境凈化領(lǐng)域顯示出巨大潛力[1]。石墨烯（G）是一種新興碳素材料，是由碳原子組成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，也是目前已知的最薄、最堅(jiān)硬、導(dǎo)電性最好的納米材料[2]。氧化石墨烯（GO）是重要的石墨烯衍生物之一，可作為新生代污水處理膜、新型吸附劑及監(jiān)測(cè)環(huán)境污染的電極材料，可以改變污染物的環(huán)境行為[3]。碳納米管（CNT）由于其穩(wěn)定性、較強(qiáng)的金屬性和導(dǎo)電性而廣泛用于航空航天、汽車和電子工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[4]。然而，在大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的同時(shí)，碳納米材料不可避免地被釋放到生態(tài)系統(tǒng)中，這無(wú)疑增加了其環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，碳納米材料對(duì)不同生物的毒性效應(yīng)受到關(guān)注。Zhu等[5]研究表明，400 mg·L-1和600 mg·L-1氧化石墨烯暴露36 h后，顯著降低鹵蟲(chóng)的孵化率，且幼蟲(chóng)中丙二醛含量、總抗氧化能力、活性氧和超氧化物歧化酶活性均顯著增加。Myer等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，添加0.318 mg·g-1的碳納米管48 h后模糊網(wǎng)紋蚤的死亡率顯著降低。

高羊茅是禾本科多年生植物，作為我國(guó)北方廣泛應(yīng)用的草坪草之一，其具有很強(qiáng)的抗逆性，能夠耐寒、耐貧瘠，抗病能力強(qiáng)，在水土保持、城市綠化、草坪建植等方面發(fā)揮著巨大的作用[7]。蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無(wú)脊椎動(dòng)物，在土壤結(jié)構(gòu)及肥力的形成和維持等諸多方面起著重要作用[8]。此外，蚯蚓在土壤中位于食物鏈的底端，能夠和土壤中的各類物質(zhì)直接接觸，對(duì)土壤環(huán)境中的外源物質(zhì)反應(yīng)敏感，存在于土壤中的各種污染物質(zhì)會(huì)對(duì)蚯蚓產(chǎn)生不同程度的影響[9]。赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia foetida）已經(jīng)被視為土壤生態(tài)毒理研究的主要模式生物。生物對(duì)環(huán)境脅迫的生物化學(xué)反應(yīng)被認(rèn)為是環(huán)境污染的早期警告指數(shù)，許多酶活性已被認(rèn)為是環(huán)境污染的生物標(biāo)志物[10-11]。暴露于環(huán)境污染物的生物體中會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（ROS），過(guò)量的ROS能氧化誘導(dǎo)破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，從而干擾細(xì)胞的正常功能[12]。為了抵抗氧化應(yīng)激，生物體內(nèi)具有與ROS相互作用的酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等。

有關(guān)碳納米材料對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)已有一些報(bào)道，較多地集中于碳納米管及其在蚯蚓體內(nèi)的富集[13]。多壁碳納米管的急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)蚯蚓有輕微的毒性[14]；Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，改性納米碳黑對(duì)蚯蚓具有一定的毒性，可抑制蚯蚓抗氧化酶的活性。但有關(guān)石墨烯、氧化石墨烯和碳納米管在草坪建植體系中對(duì)蚯蚓的毒性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取具有代表性的高羊茅和赤子愛(ài)勝蚓為模式生物，石墨烯、氧化石墨烯和羧基化碳納米管為實(shí)驗(yàn)材料，探究碳納米材料作為吸附劑施于草坪基質(zhì)中對(duì)高羊茅的生長(zhǎng)、蚯蚓體內(nèi)酶活性和丙二醛（MDA）含量的影響，以了解不同新型碳納米吸附材料進(jìn)行土壤修復(fù)的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)，為早期診斷和評(píng)價(jià)環(huán)境中碳納米材料生態(tài)污染風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試土壤為天津師范大學(xué)校園土壤，其主要理化性質(zhì)：含水量16.2%，pH 7.12，電導(dǎo)率1950 –S·cm-1，有機(jī)質(zhì)、全氮和全磷含量分別為41.39、1.96、3.18 g·kg-1。草坪植物選用我國(guó)北方廣泛應(yīng)用的高羊茅（Festuca arundinacea）。生活垃圾堆肥來(lái)自天津小淀垃圾堆肥處理廠，基本性質(zhì)：pH 7.49，電導(dǎo)率2300–S·cm-1，有機(jī)質(zhì)、全氮和全磷含量分別為131.84、25.09、6.81 g·kg-1。石墨烯（G）微片由南京吉倉(cāng)納米科技有限公司生產(chǎn)，為黑色無(wú)規(guī)則薄片，微片大小0.5～20 –m，比表面積40～60 m2·g-1；氧化石墨烯（GO）購(gòu)自蘇州恒球石墨烯科技有限公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4～7 nm，片層直徑10～50 –m，比表面積100～300 m2·g-1；羧基化碳納米管（CNT）購(gòu)自北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20～40 nm，長(zhǎng)度10～30 –m，比表面積>110 m2·g-1。蚯蚓選用赤子愛(ài)勝蚓（Eisenia foetida），實(shí)驗(yàn)前先馴化7 d，環(huán)帶明顯的蚯蚓清腸24 h后，選擇體重300～500 mg的健壯成體放入不同處理進(jìn)行培養(yǎng)，以牛糞為蚯蚓飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用塑料盆（高14 cm、內(nèi)徑18 cm），底部鋪墊尼龍網(wǎng)以防蚯蚓爬出。每盆裝校園土壤1000 g，3種碳納米材料均設(shè)定土壤質(zhì)量的1%和3%兩個(gè)比例，每盆添加35 g垃圾堆肥供植物生長(zhǎng)所需。另外，每盆再添加150 g牛糞作為蚯蚓飼料。以不添加碳納米材料的處理為對(duì)照（CK），各處理設(shè)置3個(gè)平行。土壤與碳納米材料、堆肥、牛糞混勻后裝盆，每盆添加蚯蚓20條，播入草坪植物高羊茅種子3.5 g。塑料盆隨機(jī)排列，每5 d移動(dòng)位置以保證光照一致，實(shí)驗(yàn)期間溫度為25～34℃，相對(duì)濕度45%～65%，光照為自然入射光，培養(yǎng)期間按需補(bǔ)充水分。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 高羊茅地上生物量的測(cè)定

90 d后，將高羊茅齊地面刈割。先稱鮮質(zhì)量，然后置于烘箱85℃條件下烘干至恒質(zhì)量。

1.3.2 蚯蚓抗氧化酶、GST活性和MDA含量的測(cè)定

酶液制備過(guò)程如下：取清腸24 h后的蚯蚓洗凈吸干水分稱質(zhì)量，按照質(zhì)量體積比1∶10加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）迅速研磨，之后離心5 min（10 000 r·min-1，4 ℃），提取上清液。采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行酶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[16]。SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定[17]，以抑制NBT光化學(xué)還原50%所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。CAT的測(cè)定參照徐鏡波等[18]方法，25℃下，100 s內(nèi)使H2O2分解50%時(shí)的酶蛋白量為一個(gè)酶活單位。POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法[19]，每分鐘內(nèi)470 nm下吸光值變化0.01為一個(gè)酶活單位。GST活性采用1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）比色法[20]，用分光光度計(jì)測(cè)定340 nm下1 min OD340的變化值；MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用SPSS 17.0軟件完成數(shù)據(jù)處理，利用Oneway ANOVA單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析（Duncan，P＜0.05），采用SigmaPlot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳納米材料對(duì)高羊茅株高和生物量的影響

草坪植物的地上生長(zhǎng)直接關(guān)系到草坪的質(zhì)量和成坪效果，而株高和生物量是衡量高羊茅生長(zhǎng)的重要指標(biāo)。和CK相比，添加1%G使高羊茅株高增加3.4%，其余碳納米材料處理株高均出現(xiàn)了降低，但各處理之間差異不顯著（表1，P>0.05）。高羊茅地上鮮質(zhì)量和干質(zhì)量以1%的GO為最低，但各處理間也均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。由此表明，碳納米材料對(duì)高羊茅的地上生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性影響。

2.2 碳納米材料對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性的影響

SOD廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物中，可以清除超氧化物自由基，是預(yù)防活性氧的第一道防線。由圖1可以看出，赤子愛(ài)勝蚓在含有1%和3%的碳納米材料土壤中暴露3個(gè)月后，體內(nèi)的SOD活性出現(xiàn)了顯著性抑制（P＜0.05），并隨添加比例的增大，抑制率增加。1%G、3%G、1%GO、3%GO、1%CNT和3%CNT處理SOD活性抑制率分別為24.5%、30.7%、35.2%、35.9%、30.4%和39.3%。其中，3%CNT對(duì)SOD活性抑制作用最大，抑制率達(dá)到39.3%。

表1 碳納米材料對(duì)高羊茅株高和生物量的影響Table 1 Effects of carbon nanomaterials on the plant height and biomass of Festuca arundinacea

CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以緩解污染脅迫下H2O2的毒害，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。如圖1所示，暴露于1%GO，蚯蚓體內(nèi)CAT活性略高于CK，但差異不顯著。其他碳納米材料處理，CAT活性被抑制，且隨添加比例的增大抑制作用加大。暴露于3%G和3%CNT時(shí)，CAT活性的抑制率分別為22.4%和21.7%，與CK組差異不顯著（P>0.05），但與1%GO相比，CAT活性顯著降低（P＜0.05）。

POD在細(xì)胞代謝過(guò)程中也可清除H2O2。從圖1可看出，赤子愛(ài)勝蚓暴露于碳納米材料90 d，體內(nèi)POD活性均出現(xiàn)了下降。3%GO處理組出現(xiàn)了顯著的抑制作用（P＜0.05），抑制率達(dá)到37.6%；其余處理組POD活性與CK組無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

GST參與生物體的異物代謝，是一種重要的解毒酶。圖1顯示，1%G處理蚯蚓體內(nèi)GST活性（70.62 nmol·min-1·mg-1Pr）被激活，其他處理GST 活性有一定程度的降低，但和CK差異并不顯著（P>0.05）。可見(jiàn)，碳納米材料對(duì)GST活性無(wú)顯著影響。

2.3 碳納米材料對(duì)蚯蚓MDA含量的影響

脂質(zhì)過(guò)氧化是生物體中的有害過(guò)程，MDA含量可以反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平。碳納米材料對(duì)蚯蚓MDA含量的影響如圖2所示。與CK相比，各處理組中MDA含量有所波動(dòng)，以3%GO處理的MDA含量（1.05 nmol·mg-1Pr）最高，但各處理和CK差異不顯著（P>0.05）。

圖1 碳納米材料對(duì)蚯蚓酶活性的影響Figure 1 Effects of carbon nanomaterials on the enzyme activities of earthworm

圖2 碳納米材料對(duì)蚯蚓MDA含量的影響Figure 2 Effects of carbon nanomaterials on the MDA content of earthworm

3 討論

已有研究表明，低濃度的碳納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有積極作用，主要表現(xiàn)在促進(jìn)種子萌發(fā)、根系伸長(zhǎng)和提高生物量的積累等[22]。在水培實(shí)驗(yàn)中，多壁碳納米管能顯著增加植物種子的發(fā)芽率、根系和地上部的生長(zhǎng)，和對(duì)照相比，大豆和大麥的發(fā)芽率提高50%，玉米提高90%[23]。也有研究表明，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，碳納米材料對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，如生長(zhǎng)抑制、生物量下降、活性氧含量增加等[2]。碳納米材料對(duì)植物的影響可能與其作用方式和吸收途徑、對(duì)植物基因表達(dá)和根際微生物的影響有關(guān)[2]，但具體的作用機(jī)理還不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果顯示，1%和3%碳納米材料未對(duì)高羊茅的株高、地上干質(zhì)量和鮮質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，表明高羊茅對(duì)碳納米材料具有一定的耐受性。

抗氧化酶（SOD、CAT、POD）被認(rèn)為是保護(hù)生物大分子免受氧化損傷的主要防御系統(tǒng)，可以協(xié)同清除其體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，從而保護(hù)細(xì)胞免遭破壞[24]。蚯蚓體內(nèi)各種酶活性及MDA含量對(duì)碳納米材料響應(yīng)特征不同。土壤中添加碳納米材料使得SOD活性顯著降低，而CK組中SOD活性處于較高水平，表明SOD活性受到抑制。通常情況下，當(dāng)蚯蚓受到輕度污染脅迫時(shí)，SOD活性被誘導(dǎo)，當(dāng)受到重度逆境脅迫時(shí)，SOD活性會(huì)降低[25]。在碳納米材料脅迫下，蚯蚓的代謝平衡受到破壞，引起代謝產(chǎn)物活性氧的積累。SOD活性的降低可能是由于清除過(guò)多的氧自由基而導(dǎo)致酶失活[26]。碳納米材料含量越高，蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基數(shù)量越多，且3%CNT引起的損傷更大，SOD活性受抑制更顯著。Zhao等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，改性納米碳黑均顯著降低了蚯蚓的SOD活性，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

在活性氧轉(zhuǎn)化過(guò)程中，產(chǎn)生的H2O2對(duì)細(xì)胞也有一定的毒害作用，CAT可以將其分解，使細(xì)胞免受毒害[27]。本實(shí)驗(yàn)中，3%CNT和3%G顯著抑制CAT活性，這可能與納米材料本身的性質(zhì)、濃度大小和持續(xù)時(shí)間有關(guān)。高含量的碳納米材料處理下CAT活性降低，可能是自由基導(dǎo)致的酶失活，或與合成相關(guān)酶的蛋白質(zhì)減少或受損有關(guān)；其活性的抑制將導(dǎo)致H2O2的累積，有可能對(duì)蚯蚓造成過(guò)氧化損傷[28]。

POD與CAT對(duì)于清除生物體內(nèi)過(guò)量的H2O2具有很好的協(xié)同作用，二者在細(xì)胞中存在的位置不同，而使其分工存在差異[29]。添加碳納米材料后POD活性降低，其中3%GO抑制作用最顯著，這可能與碳納米材料本身的尺寸、層數(shù)、團(tuán)聚狀態(tài)、結(jié)構(gòu)缺陷、氧化程度等性質(zhì)有關(guān)[30]?？傮w來(lái)說(shuō)，添加碳納米材料后，蚯蚓體內(nèi)SOD、POD和CAT活性出現(xiàn)了降低，SOD對(duì)碳納米材料的敏感性大于CAT和POD。

GST作為第二階段解毒酶，可催化污染物與GSH結(jié)合，生成極性的小分子物質(zhì)，從而減輕其毒性[31]。而碳納米材料并未引起GST活性的顯著變化，這可能是因?yàn)槠涠拘晕闯^(guò)蚯蚓的耐受范圍，GST未發(fā)揮作用。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)在受活性氧脅迫后而形成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，它反映了蚯蚓機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)和活性氧間的平衡，進(jìn)一步間接反映了蚯蚓對(duì)外源干擾的適應(yīng)能力[32]。MDA含量各處理與CK無(wú)明顯差異，說(shuō)明蚯蚓體內(nèi)可以通過(guò)抗氧化酶的調(diào)節(jié)，緩解脂質(zhì)過(guò)氧化，使機(jī)體處于平衡狀態(tài)。

4 結(jié)論

（1）草坪基質(zhì)中添加一定比例的碳納米材料未對(duì)高羊茅產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，高羊茅對(duì)碳納米材料的耐受性較好，抗逆性強(qiáng)。

（2）蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性對(duì)碳納米材料的響應(yīng)總體上表現(xiàn)為下降，表明碳納米材料能引起蚯蚓體內(nèi)的毒性效應(yīng)，抑制抗氧化酶的活性。其中SOD活性均顯著低于CK，因此在蚯蚓抗氧化酶中可以選取SOD作為碳納米材料污染程度的指示指標(biāo)。

（3）碳納米材料對(duì)蚯蚓體內(nèi)的GST酶活和MDA含量無(wú)明顯影響，蚯蚓可能通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)或其他機(jī)制進(jìn)行自我修復(fù)，減輕毒害作用。