黃芯琦,周小媚，鐘可,2*，劉珂，楊婷婷,張丹

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

百合科百合屬植物淡黃花百合(LiliumsulphureumBaker)是山百合藥材的基原之一，收載于2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，藥用部位為干燥的肉質(zhì)鱗葉，是貴州省常用的民族民間藥，具有清心安神，養(yǎng)陰潤(rùn)肺之功效[1]。多糖是百合科百合屬植物的活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[2-4]。目前，有關(guān)山百合藥材中多糖含量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本文擬以黔產(chǎn)淡黃花百合為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖的含量，并對(duì)顯色條件、提取條件進(jìn)行了摸索考察，建立最佳的含量測(cè)定方法。對(duì)貴州不同產(chǎn)地的淡黃花百合的多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，為山百合藥材質(zhì)量研究提供參考。

1 材料

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用淡黃花百合采自貴州省，均為野生品，來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院張文龍副教授和鐘可副教授鑒定為百合科植物淡黃花百合LiliumsulphureumBaker。鱗莖放入烘箱低溫烘干，粉碎過(guò)4號(hào)篩備用。D-無(wú)水葡萄糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833-201506，僅供國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)用)；95%乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR，批號(hào)：20151222)；苯酚(重慶川東化工有限公司，AR，批號(hào)：20130501)；濃硫酸(重慶川東化工有限公司，AR，批號(hào)：20160601)；實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，UV—5900)；電子天平(XS205，瑞士梅特勒公司)；回流裝置；水浴鍋(常州澳華儀器有限公司，HH-6)；數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊公司，GZX-9070MBE)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.02 mg于50 mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得到濃度為0.200 4 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密移取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL于15 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL[5-6]，搖勻，常溫避光靜置顯色40 min，以相應(yīng)試劑為空白，掃描吸收光譜(200～800 nm)。見(jiàn)圖1。

精密移取2.5.3項(xiàng)下供試品溶液2 mL于15 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，常溫避光靜置顯色40 min，以相應(yīng)試劑為空白，掃描吸收光譜(200～800 nm)。見(jiàn)圖2。

掃描結(jié)果表明，在489.5 nm處葡萄糖對(duì)照品和樣品溶液有最大吸收，故選擇489.5 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 樣品來(lái)源

圖1 葡萄糖對(duì)照品波長(zhǎng)掃描圖

圖2 樣品波長(zhǎng)掃描圖

2.3 顯色條件的確定

精密量取2.1項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液8 mL，置于50 mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取該溶液2 mL置于15 mL的具塞試管中，加入5%苯酚1 mL混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，按表2的條件顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm處測(cè)其吸光度。

表2 多糖顯色條件考察(n=3)

由以上結(jié)果確定顯色條件為：精密吸取上述溶液2 mL置于15 mL的具塞試管中，加入5%苯酚1 mL混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，避光靜置40 min，顯色。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取2.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液2、3、4、5、6 mL置于25 mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密吸取上述各溶液2 mL置于15 mL的具塞試管中加入5%苯酚1 mL混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，混勻，常溫避光靜置顯色40 min，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm處測(cè)其吸光度，以葡萄糖對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。得到回歸方程為A=13.076x+0.057，r=0.999 8，線性范圍0.016 0～0.048 1 mg/mL。

2.5 供試品提取條件考察

同屬藥用植物多糖的含量測(cè)定中常用的提取方法有回流提取和超聲波提取，回流提取操作簡(jiǎn)單、成本低廉但時(shí)間長(zhǎng)，超聲提取操作簡(jiǎn)便、快速[7]。為了明確哪種方法更適合淡黃花百合中多糖的提取，本實(shí)驗(yàn)比較了回流提取與超聲提取。

2.5.1 超聲提取

精密稱取5號(hào)樣品粉末，每份約50 mg，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，超聲30 min，于90℃水浴揮干，得濾渣；加水50 mL于50℃下超聲提取30 min、45 min、60 min，過(guò)濾，取濾液于250 mL容量瓶中，殘?jiān)谜麴s水洗滌，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取上述溶液2 mL于具塞15 mL試管中，按2.3項(xiàng)下條件顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超聲提取時(shí)間考察(n=3)

由測(cè)定結(jié)果可知：超聲提取60 min時(shí)，多糖含量最高，所以將多糖超聲提取的時(shí)間定為60 min。

精密稱取5號(hào)樣品粉末，每份約50 mg，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL95%乙醇，超聲30 min，于90℃水浴揮干，得濾渣；加水50 mL于30℃、40℃、50℃下超聲提取60 min，過(guò)濾，取濾液于250 mL容量瓶中，殘?jiān)谜麴s水洗滌，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取上述溶液2 mL于具塞15 mL試管中，按2.3項(xiàng)下條件顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 超聲提取溫度考察(n=3)

由測(cè)定結(jié)果可知：超聲提取溫度為50℃時(shí)，多糖含量最高，所以將多糖的超聲提取溫度定為50℃。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲提取的最佳條件為：超聲溫度50℃下提取60 min。

2.5.2 回流提取

精密稱取5號(hào)樣品粉末，每份約50 mg，置250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL95%乙醇，于80℃下回流30 min，90℃水浴揮干，收集濾渣；冷卻至室溫，加水50 mL，溫度固定為蒸餾水的沸點(diǎn)，沸騰后回流1 h、1.5 h、2 h[8]，過(guò)濾，得濾液，置于250 mL容量瓶中，殘?jiān)谜麴s水洗滌，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密量取上述溶液2 mL于具塞15 mL試管中，按2.3項(xiàng)下條件顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)表5。

表5 回流提取時(shí)間考察(n=3)

由測(cè)定結(jié)果可知：回流提取的最佳提取條件為：沸騰后提取1.5 h。

2.5.3 供試品溶液制備方法的確定

通過(guò)比較超聲提取與回流提取多糖的含量，供試品溶液的最佳制備方法為：精密稱取藥材粉末，每份約50 mg，置250 mL圓底燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，于80℃下回流30 min，90℃水浴揮干，收集濾渣；冷卻至室溫，加水50 mL，沸騰后回流1.5 h，過(guò)濾，得濾液，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，殘?jiān)谜麴s水洗滌，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.6 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.032 1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL于15 mL具塞試管中，按2.3項(xiàng)下操作，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)連續(xù)測(cè)定6次。記錄其吸光度值，RSD=0.88%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取5號(hào)樣品粉末，每份約50 mg于250 mL的圓底燒瓶中，照2.5.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下操作，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下連續(xù)測(cè)定5次，分別于0、0.5、1.5、3.5、6.5 h測(cè)定其吸光度值，RSD=1.9%。結(jié)果表明本法所測(cè)樣品在6.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份5號(hào)樣品粉末，每份約50 mg于250 mL圓底燒瓶中，照2.5.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，按2.3項(xiàng)下操作，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定其吸光度值，并由回歸方程計(jì)算樣品中多糖的百分含量。得平均含量為19.96%，RSD=2.7%，結(jié)果所測(cè)樣品的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取5號(hào)樣品粉末6份，每份約25 mg于250 mL的圓底燒瓶中，照2.5.3項(xiàng)方法制備，過(guò)濾得濾液后，在每份樣品中分別加入5.0 mg的葡萄糖對(duì)照品，加水定容至250 mL容量瓶。按2.3項(xiàng)下操作，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定吸光度并計(jì)算回收率，得平均回收率為99.1%，RSD=0.95%，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.10 樣品中多糖的含量測(cè)定

按2.5.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，按2.3項(xiàng)下操作，以相應(yīng)試劑為空白，在489.5 nm下進(jìn)行測(cè)定，由回歸方程計(jì)算樣品中多糖的百分含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明苯酚-硫酸法簡(jiǎn)便、靈敏且重現(xiàn)性好，顯色物在6.5 h內(nèi)穩(wěn)定，能有效的應(yīng)用于淡黃花百合中多糖的含量的測(cè)定。在提取條件的考察中，超聲提取的最佳條件為50℃下超聲提取60 min；回流提取最佳條件為沸騰后提取1.5 h。兩者相比較，超聲提取法成本較高、但快速簡(jiǎn)便，回流提取法操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)；回流提取法多糖得率較超聲提取法更高，故選用回流提取法。本實(shí)驗(yàn)以黔產(chǎn)淡黃花百合為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)12個(gè)批次的樣本中多糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示貴州不同產(chǎn)地的淡黃花百合的多糖含量存在差異，多糖的含量范圍為18.58%～37.53%，平均含量為24.07%，其中產(chǎn)于花溪區(qū)的淡黃花百合多糖含量較高。淡黃花百合為多年生草本植物，所采集的樣品均為野生品，由于生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)年限的不同，鱗莖大小不一，多糖含量的高低是否與其有關(guān)，還需做進(jìn)一步研究。