孫靜，陸賽衛(wèi)，高英杰，趙榮華，郭姍姍，時(shí)宇靜，曲天歌，玄振玉*，崔曉蘭*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.蘇州玉森新藥開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215001； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700)

急性細(xì)菌性咽炎是由細(xì)菌感染引起的咽部黏膜、黏膜下組織及其淋巴組織的急性炎癥，是耳鼻喉科常見(jiàn)病、多發(fā)病，主要表現(xiàn)為咽喉紅腫疼痛等癥狀[1]。西醫(yī)多采用抗生素類藥物治療急性細(xì)菌性咽炎，但藥物毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性[2]。中藥治療急性細(xì)菌性咽炎具有毒副作用小、藥效持久，辨證論治，標(biāo)本兼治等特點(diǎn)。咽喉寧口服液功能主治為清熱解毒，清利咽喉，臨床用于急性咽炎的治療。本研究采用乙型溶血性鏈球菌感染致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型及體內(nèi)外抗菌、鎮(zhèn)痛、止癢模型，評(píng)價(jià)咽喉寧口服液治療急性細(xì)菌性咽炎的藥效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑

咽喉寧口服液干膏粉(批號(hào)：141101)，由蘇州玉森新藥開(kāi)發(fā)有限公司提供；咽炎片(批號(hào)：1312030Z)，華潤(rùn)三九(黃石)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；阿莫西林膠囊(批號(hào)：A1406029)，哈藥集團(tuán)制藥總廠產(chǎn)品；阿司匹林腸溶片(批號(hào)：BJ09503)，拜耳公司產(chǎn)品；醋酸潑尼松片(批號(hào)：1409157)，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品；組織胺磷酸(批號(hào)：51-74-1)，杭州大陽(yáng)化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠(SPF/VAF級(jí))，體質(zhì)量13～15 g，18～20 g，SD大鼠(SPF/VAF級(jí))，體質(zhì)量140～160 g，雌雄各半，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證：SCXK(京)2012-0001；豚鼠，體質(zhì)量250～350 g，雌雄各半，普通級(jí)，由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證：SCXK(京)2015-0005。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(YP1002)，上海越平科學(xué)儀器有限公司；電子天平(BSA3202S-CW)，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；恒溫水浴箱(DK-660B)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；咽喉噴霧器，貴州宏宇藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.1 對(duì)乙型溶血性鏈球菌致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型的影響

取SD大鼠60只，體質(zhì)量140～160 g，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、咽炎片對(duì)照組、咽喉寧口服液干膏粉1.16 g/(kg·d)、0.58 g/(kg·d)、0.29 g/(kg·d)3個(gè)劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，使用滅菌鑷子翻開(kāi)大鼠口腔，暴露上頜黏膜，用注射器將吸有1×109cfu/mL濃度乙型溶血性鏈球菌菌液水平方向點(diǎn)刺鼻咽部黏膜，并注射菌液，操作程度以略有點(diǎn)狀出血為度，每只0.1 mL，連續(xù)感染2 d。第1天感染后1 h各動(dòng)物按10 mL/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組在同等條件下給蒸餾水。第4天觀察大鼠咽部黏膜病變程度，進(jìn)行咽部體征評(píng)分。咽部體征評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：4分：軟腭、軟腭弓、咽后壁均出現(xiàn)紅色瘀血點(diǎn)，可見(jiàn)覆有白色膿點(diǎn)；3分：軟腭、軟腭弓、咽后壁出現(xiàn)紅色瘀血點(diǎn)；2分：軟腭、軟腭弓或咽后壁有充血紅腫；1分：軟腭有紅腫；0分：上顎無(wú)紅腫表現(xiàn)[3]。

2.2 體外抗菌作用

試驗(yàn)前將咽喉寧口服液及咽炎片用蒸餾水配制成50 mg/mL的原藥液；阿莫西林膠囊配制成濃度為5 mg/mL的原藥液，過(guò)濾除菌備用。菌液制備：試驗(yàn)前取保存的各菌液，每種20 μL加入到肉湯培養(yǎng)基2 mL中，置入振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。試驗(yàn)時(shí)將培養(yǎng)好的菌液用肉湯培養(yǎng)基逐步稀釋成3×105個(gè)菌/mL濃度。試驗(yàn)時(shí)用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將各原藥液做1:2～1:64倍倍比稀釋后，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔150 μL，再加入3×105個(gè)菌/mL的各種菌液10 μL，每個(gè)濃度做2個(gè)復(fù)孔同時(shí)設(shè)細(xì)菌對(duì)照組和正常對(duì)照組。置振蕩培養(yǎng)箱，36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各孔中細(xì)菌生長(zhǎng)情況，確定無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度(MIC)。

2.3 對(duì)金黃色葡萄球菌感染致小鼠死亡的保護(hù)作用

取ICR小鼠120只，體質(zhì)量13～15 g，雌雄各半，按體質(zhì)量等級(jí)隨機(jī)分為6組，分別為模型對(duì)照組、阿莫西林對(duì)照組、咽炎片對(duì)照組，咽喉寧口服液高、中、低3個(gè)劑量組，每組20只。各給藥組灌胃給藥，0.02 mL/g，每日1次，連續(xù)5 d，感染對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。第3天給藥1 h后各組動(dòng)物腹腔注射9×108cfu/mL金黃色葡萄球菌菌液，0.2 mL/只。感染后每日觀察動(dòng)物的死亡情況，連續(xù)7 d，記錄死亡數(shù)，計(jì)算死亡率、保護(hù)率、平均存活天數(shù)及生命延長(zhǎng)率。

2.4 對(duì)熱板致小鼠疼痛模型的影響

調(diào)節(jié)恒溫水?。合葘⑺〔奂訚M水，使水面接觸熱板，調(diào)節(jié)恒溫裝置，使水溫控制在(55.0±0.5)℃，熱板需預(yù)熱10 min。

篩選合格小鼠：取ICR小鼠，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，每次1只放在熱板上，小鼠自放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所需時(shí)間(s)，作為該鼠的痛閾值，凡舔后足時(shí)間小于5 s或大于30 s或跳躍者棄之不用。

觀察藥物作用：取合格小鼠60只，按體質(zhì)量等級(jí)分為模型對(duì)照組、阿司匹林對(duì)照組、咽炎片對(duì)照組，咽喉寧口服液高、中、低3個(gè)劑量組，每組10只。各組小鼠重復(fù)測(cè)其正常痛閾值2次，取2次平均值，作為該鼠給藥前痛閾值。各給藥組小鼠灌胃給藥，0.02 mL/g，模型對(duì)照組在同等情況下給蒸餾水。給藥后1 h、2 h、3 h分別測(cè)小鼠痛閾值，如60 s仍無(wú)反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計(jì)算。

根據(jù)痛閾值計(jì)算鎮(zhèn)痛率，以鎮(zhèn)痛率來(lái)比較各組的鎮(zhèn)痛效果。

鎮(zhèn)痛率%=(用藥后痛閾值-用藥前平均痛閾值)×100%/用藥前平均痛閾值

2.5 對(duì)組胺致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

取豚鼠70只，體質(zhì)量250～350 g，雌性各半，隨機(jī)分為7組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，咽炎片對(duì)照組，醋酸潑尼松對(duì)照組、咽喉寧口服液高、中、低劑量組。各給藥組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組在同等情況下灌胃蒸餾水。第3天給藥2 h后將各組豚鼠右后足背脫毛，用砂紙擦傷豚鼠右后足背脫毛處，面積約1 cm2，除正常對(duì)照組外其余動(dòng)物在創(chuàng)面處滴0.1%組胺磷酸液0.05 mL/足，以后每隔3 min將組胺磷酸液滴在創(chuàng)面上，直至豚鼠回頭舔右后足為止，以此時(shí)所給的組胺磷酸總量為致癢閾。若滴加10次，豚鼠仍沒(méi)回頭舔后足，則以10次所給的組胺磷酸量為致癢閾。正常對(duì)照組同等情況下滴蒸餾水。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

結(jié)果采用組間比較t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)乙型溶血性鏈球菌致大鼠急性細(xì)菌性咽炎模型的影響

表1結(jié)果顯示：肉眼觀察模型組大鼠咽部出現(xiàn)紅色瘀血點(diǎn)并附有白色膿點(diǎn)，咽部體征評(píng)分顯著增高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)；咽喉寧口服液3個(gè)劑量組大鼠咽部病變均明顯減輕，咽部體征評(píng)分下降，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)。

注：與正常對(duì)照組比較，##P<0.01,#P<0.05；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01,*P<0.05

3.2 體外抗菌作用

表2結(jié)果顯示：經(jīng)24 h培養(yǎng)后，細(xì)菌對(duì)照組均有菌株生長(zhǎng)。咽喉寧口服液對(duì)所試的6株菌株均有不同程度的抑制作用，MIC在6.25～25 mg/mL之間。

3.3 對(duì)金黃色葡萄球菌感染致小鼠死亡的保護(hù)作用

表3結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個(gè)劑量組均可降低金黃色葡萄球菌感染所致小鼠死亡數(shù)，其中中劑量組死亡保護(hù)率為38.89%，并延長(zhǎng)平均存活天數(shù)，中、小劑量組生命延長(zhǎng)率分別為139.39%和103.03%，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異，(P<0.05，P<0.01)。

3.4 對(duì)熱板致小鼠疼痛模型的影響

表4結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個(gè)劑量組給藥后1 h、2 h、3 h均可提高熱板致小鼠疼痛的鎮(zhèn)痛率，其中高、中劑量組給藥后3 h與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。

表2 咽喉寧口服液體外抑菌試驗(yàn)

注：“-”表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，“ +”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)

表3 咽喉寧口服液對(duì)金黃色葡萄球菌致小鼠死亡的保護(hù)作用

注：與模型對(duì)照組比較，**P<0.01，*P<0.05

表4 咽喉寧口服液對(duì)熱板所致小鼠疼痛模型的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 對(duì)組胺致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

表5結(jié)果顯示：咽喉寧口服液3個(gè)劑量組均可提高組胺致豚鼠的致癢閾，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。

表5 咽喉寧口服液對(duì)組胺所致豚鼠皮膚瘙癢模型的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

急性細(xì)菌性咽炎是細(xì)菌感染引起的咽部黏膜，并波及黏膜下及淋巴組織的急性炎癥，常繼發(fā)于急性鼻炎或急性扁桃體炎之后或?yàn)樯虾粑栏腥局徊糠諿4-5]。亦常為全身疾病的局部表現(xiàn)或?yàn)榧毙詡魅静≈膀?qū)癥狀。常因受涼，過(guò)度疲勞，煙酒過(guò)度等致全身及局部抵抗力下降，病原菌乘虛而入而引發(fā)本病。引起急性細(xì)菌性咽炎的致病菌包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌等，其中乙型溶血性鏈球菌是臨床最易引起兒童及成人上呼吸道感染，從而引發(fā)咽喉炎、扁桃體炎的致病力較強(qiáng)的病原菌[6-8]。當(dāng)前，臨床治療急性細(xì)菌性咽炎的藥物仍以抗生素為主，但抗生素耐藥及毒副作用問(wèn)題日益嚴(yán)重，因此，醫(yī)學(xué)界越來(lái)越偏重于發(fā)展中醫(yī)藥治療。中藥復(fù)方因化學(xué)成分復(fù)雜、治療面廣，對(duì)于恢復(fù)人體微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防感染、干預(yù)抗藥性形成都具有較好的作用[9-10]。

咽喉寧口服液由山豆根、龍葵、射干、黃芪、甘草組成，具有清熱解毒，清利咽喉的功效，臨床治療各種急、慢性咽炎，療效顯著。方中山豆根性寒、味苦；有清熱解毒，消腫利咽之功效，為君藥；龍葵性寒、味苦，有清熱解毒，活血消腫之功效；射干性寒、味苦，有清熱解毒、散結(jié)消炎、消腫止痛、止咳化痰之功效，與龍葵共為臣藥；黃芪性溫、味甘，有補(bǔ)氣固表、利水退腫之功效，能減緩山豆根、射干的苦寒之性，為佐藥。甘草為使藥，具有補(bǔ)脾益氣，袪痰止咳，調(diào)和諸藥之功效。本研究結(jié)果表明咽喉寧口服液3個(gè)劑量組對(duì)乙型溶血性鏈球菌感染引起的大鼠急性咽炎均具顯著的療效，給藥組大鼠咽部體征評(píng)分與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。體內(nèi)外抗菌試驗(yàn)、熱板實(shí)驗(yàn)和組胺致豚鼠皮膚瘙癢實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示咽喉寧口服液3個(gè)劑量組均具有不同程度的體內(nèi)外抗菌、鎮(zhèn)痛、止癢作用。