苗宗寧，孫鴻麗，薛一峰△

(1.無錫市第三人民醫(yī)院研究所，無錫 214041；2.南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院，無錫 214023)

1 引 言

組織工程技術(shù)在臨床研究中顯示出誘人的前景和巨大的潛能，而體外構(gòu)建的組織工程組織血管化研究仍然是亟待解決的關(guān)鍵問題，血管內(nèi)皮細胞是此問題的核心。血管內(nèi)皮細胞是一種終末分化的細胞，體外大量增殖相對困難，因此影響了臨床上的廣泛應(yīng)用[1]。尋找一種具有內(nèi)皮細胞特性，且能大量繁殖的種子細胞就成為組織工程研究的熱點之一。利用干細胞具有自我更新和多向分化潛能的特性，在體外定向誘導分化成血管內(nèi)皮(前體)細胞是全新思路。2004 年Oswald 等[2]首次在體外用VEGF 誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞分化，誘導后的細胞具備血管內(nèi)皮細胞的某些特征。VEGF又稱促血管因子，能特異性促內(nèi)皮細胞遷移、增殖及形成管腔樣結(jié)構(gòu)的重要刺激因子。而 bFGF對VEGF 具有非特異性促增殖作用，與VEGF 產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，能夠促進MSCs 分化為內(nèi)皮細胞和形成小管樣結(jié)構(gòu)[3]。有學者用包含VEGF、bFGF等的EBM-2培養(yǎng)基誘導MSCs向血管內(nèi)皮細胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導后的細胞表達血管內(nèi)皮細胞的特異性標志，血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1(CD31)和vWF因子，在體外可形成毛細血管樣的結(jié)構(gòu)，具有與人血管內(nèi)皮細胞一樣的表型和功能特征[4]。本研究通過觀察人絨毛膜來源間充質(zhì)干細胞(chorionic membrane mesenchymal stem cells，CMSCs)在膠原蛋白海綿中的表型以及向血管內(nèi)皮細胞分化潛能，明確膠原海綿對CMSCs細胞的生物相容性，評價CMSCs和膠原海綿在組織工程血管化研究中的應(yīng)用前景。

2 材料與方法

2.1 組織標本來源

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，在產(chǎn)婦知情同意的情況下，獲取正常健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮胎盤組織，無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病，無遺傳性疾病史，大小及重量在正常范圍內(nèi)。

2.2 實驗試劑與儀器

DMEM-LG，Newborn Calf Serum，Penicillin-Streptomycin-Neomycin，胰蛋白酶(Gibco)； Anti-CD31，Anti-vWF(Abcam)； IV型膠原酶，DAPI(Sigma)；Recombinant human VEGF，bFGF(Peprotech)；Matrigel? Basement Membrane Matrix(BD)；膠原海綿(無錫貝迪生物有限公司)。

2.3 方法

2.3.1hCMSCs分離培養(yǎng)鑒定 參照項目組前期文獻[5-6]，無菌條件下機械分離胎盤絨毛膜組織，用預(yù)冷的D-Hank’s緩沖液反復沖洗去除血細胞，用眼科剪將絨毛膜組織盡可能剪成細碎小塊，0.1%IV型膠原酶，37℃水浴消化15 min，200目細胞篩網(wǎng)過濾， 1500 rpm離心10 min，收集沉淀細胞，調(diào)整濃度為1×106/mL接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)基包括DMEM-LG、1%Penicillin-Streptomycin、10% FBS、10 ng/mL bFGF。37℃、5%CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)。細胞密度達到80%，融合后用0.25%胰蛋白酶消化，1瓶分2瓶的比例傳代培養(yǎng)。

2.3.2hCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化及鑒定 0.25%的胰蛋白酶消化后，收集培養(yǎng)第二代hCMSCs，調(diào)整細胞濃度至1×105/ mL接種于6孔板，生長密度達到50%時，用D-Hank’s緩沖液洗2遍，實驗組加入條件培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 ng/mL VEGF)誘導培養(yǎng)，每2 d 換液，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；對照組繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。連續(xù)誘導培養(yǎng)14 d 后，實驗組和對照組細胞進行CD31和vWF免疫熒光染色，并計算陽性細胞比例。

2.3.3Matrigel成管實驗 將Matrigel基底膜基質(zhì)置于4℃冰水浴中融化，按30 μL/well鋪于96孔板，在 37℃培養(yǎng)箱放置 1 h后，實驗組收集誘導分化的細胞按5×103/well的密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)，2 h后，開始在倒置顯微鏡下觀察細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)，對照組接種相同數(shù)量的hCMSCs，24 h后通過CD31、vWF單克隆抗體免疫熒光染色觀察實驗組和對照組毛細血管樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)。

2.3.4hCMSCs與膠原海綿復合培養(yǎng)并向血管內(nèi)皮細胞誘導分化 無菌條件下將膠原海綿制成5 mm×5 mm×2 mm大小，用PBS緩沖液濕潤1 h，再用含體積分數(shù)為10%的胎牛血清的DMEM浸泡1 h。收集培養(yǎng)的第三代hCMSCs，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL；取24孔培養(yǎng)板，將裁剪好的膠原海綿置于孔內(nèi)，滴加100 μL細胞懸液；將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育1 h；取出，將膠原海綿翻轉(zhuǎn)，滴加100 μL細胞懸液，37℃繼續(xù)孵育1 h，實驗組取出后，加入800 μL條件培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50 ng/mL VEGF)，對照組應(yīng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)14 d，每2 d 更換培養(yǎng)基。

2.3.5組織學檢測 將培養(yǎng)2周的hCMSCs與膠原海綿復合物(實驗組和對照組)經(jīng)石蠟包埋后切片，厚度5 μm，行HE染色和CD31、vWF免疫熒光染色分析。

2.3.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計處理，組間差異采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學顯著性。

3 結(jié)果

3.1 hCMSCs分離培養(yǎng)及生物學特性

胎盤絨毛膜組織經(jīng)膠原酶消化后收集的細胞靜置培養(yǎng)3 d，可見少量粗短的梭形或多角形的貼壁細胞，培養(yǎng)2周后才能達到 80%的融合。用胰蛋白酶消化傳代后，細胞生長速度明顯加快，接種第5 d即可達到90%融合，細胞形態(tài)呈相對均勻一致的長梭形，旋渦狀生長。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示hCMSCs表達CD73、CD90和CD105，不表達CD34和HLA-DR[5]。

3.2 hCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化

hCMSCs經(jīng)條件培養(yǎng)基向血管內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞趨于圓形，鋪路石樣排列。免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導后的細胞表達CD31和vWF，見圖1。實驗組CD31陽性細胞比例42.5±2.6%，vWF陽性細胞比例25.4±1.8%，對照組沒有陽性細胞表達，組間比較，P<0.01，具有顯著性差異。

圖1hCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化前后形態(tài)變化。左圖，A為未誘導對照組，免疫熒光染色只能觀察到藍色的細胞核×40；右圖，B為誘導實驗組，誘導14d后，CD31和vWF免疫熒光染色可見綠色陽性表達×100。

Fig1ThemorphologicalchangesofhCMSCsbeforeandafterthedifferentiationofvascularendothelialcells.Left,theimmunofluorescencestainingcanonlyobservethebluenucleusofthenucleuswithincontrolgroup(A) ×40.Right,CD31andvWFimmunofluorescencestainingshowgreenpositiveexpressionwithinexperimentalgroup(B)after14daysinduced×100.

3.3 hCMSCs血管形成實驗

實驗組hCMSCs接種于Matrigel基質(zhì)膠后，顯微鏡動態(tài)觀察表明，2 h后細胞即可貼壁、黏附，6 h后細胞逐漸集聚成團狀并向四周發(fā)散生長，逐步形成分散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，周圍聚集單層細胞，并且細胞數(shù)量逐漸增多，12 h后網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相互連接，形成管狀結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色可見形成管狀結(jié)構(gòu)的細胞CD31和vWF陽性表達，見圖2左。對照組hCMSCs接種于Matrigel基質(zhì)膠后，顯微鏡動態(tài)觀察表明，2 h后細胞即可貼壁、黏附，細胞不集聚成團狀也不形成分散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)繼而形成管狀結(jié)構(gòu)，CD31和vWF免疫熒光染色未見細胞陽性表達，見圖2右。

圖2左圖，實驗組hCMSCs在Matrigel基質(zhì)膠上血管形成實驗12h后形態(tài)，培養(yǎng)24h后CD31和vWF免疫熒光染色陽性，箭頭指示管狀結(jié)構(gòu)，Bar=200μm。右圖，對照組hCMSCs在Matrigel基質(zhì)膠上血管形成實驗12h后形態(tài)，未見管狀結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)24h后CD31和vWF免疫熒光染色陰性，Bar=100μm。

Fig2Inexperimentalgroup(left),hCMSCsformed12hontheMatrigelmatrix,andtheCD31andvWFimmunofluorescencestainingispositiveaftertheco-culturedof24h.Thearrowindicatesthetubularstructure,Bar=200μm.ThecontrolgrouphCMSCsontheMatrigelmatrixisformedafter12h,andnotubularstructureisfound(right).Afterco-culturedof24h,CD31andvWFimmunofluorescencestainingisnegative,andBar=100μm.

3.4 hCMSCs與膠原海綿復合培養(yǎng)后H-E染色

實驗組hCMSCs與膠原海綿復合培養(yǎng)2周后取材切片，H-E染色可見膠原海綿的多孔結(jié)構(gòu)非常有利于細胞長入，部分細胞沿膠原支架密集生長，細胞形態(tài)不一，大部分呈棱形和多角形，細胞核染淡藍色，呈橢圓形，胞質(zhì)染淡紅色。細胞與細胞之間相互交連。免疫熒光染色結(jié)果可見細胞散在分布，CD31和 vWF陽性表達。對照組同樣有細胞生長，免疫熒光染色未見CD31和 vWF陽性表達。由于切片取材的因素，有些陽性表達區(qū)域未見細胞核，間接表明細胞沿著材料生長，分布沒有規(guī)律，見圖3。

4 討論

間充質(zhì)干細胞是來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新、免疫原性低的特點，可分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等中胚層的組織細胞，在組織工程研究以及細胞治療方面有著廣泛的應(yīng)用[7]。本研究從人胎盤絨毛膜分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，在一定誘導條件下，通過包含VEGF、bFGF的DMEM培養(yǎng)基，誘導hCMSCs向血管內(nèi)皮細胞分化，免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導后的細胞表達內(nèi)皮細胞表面標記物CD31和vWF因子，證實hCMSCs具有向血管內(nèi)皮細胞分化的潛能。

圖3左圖，實驗組，hCMSCs與膠原海綿復合培養(yǎng)2周，HE染色結(jié)果×100，CD31和vWF免疫熒光染色結(jié)果陽性，Bar=20μm。右圖，對照組，hCMSCs與膠原海綿復合培養(yǎng)2周，HE染色結(jié)果×100，CD31和vWF免疫熒光染色結(jié)果陰性，Bar=20μm。

Fig3Intheexperimentalgroup(left),HEstainingresultsofhCMSCsandcollagenspongeco-culturedfor2weeks, ×100.CD31andvWFimmunofluorescencestainingresultsarepositive,Bar=20μm.Inthecontrolgroup(right),HEstainingresultsofhCMSCsandcollagenspongeco-culturedfor2weeks, ×100.CD31andvWFimmunofluorescencestainingresultsarenegative,Bar=20μm.

構(gòu)建組織工程研究的生物支架材料，主要是有利于種子細胞粘附、增殖以及分化等，研究表明大孔徑支架比小孔徑支架更有利于細胞生長及血管化，但其機械強度會隨之降低[8]。本研究所選的膠原海綿孔徑在50～100 μm，在和細胞復合培養(yǎng)后的第1 d，即有細胞通過基質(zhì)與材料相連，第8 d細胞大量增殖，這都說明膠原海綿與細胞間有良好親和性，適合細胞的大量增殖，這與Glowacki等認為在三維支架材料培養(yǎng)細胞有利于提高細胞增殖能力的結(jié)論相似[9]。同時本研究結(jié)果表明，hCMSCs在膠原海綿三維支架上誘導培養(yǎng)14 d后，細胞表達CD31和vWF，表明hCMSCs可以在三維支架上分化為血管內(nèi)皮細胞。hCMSCs可以在膠原海綿中增殖并且分化為血管內(nèi)皮細胞，膠原海綿具有良好的生物相容性，兩者在組織工程血管化研究中均具有廣闊的應(yīng)用前景。細胞的分化受到局部微環(huán)境的影響，三維條件下培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境更接近體內(nèi)，從而有利于細胞基質(zhì)的分泌，增加細胞與細胞、細胞與材料之間接觸面積，有利于細胞之間的相互作用、促進細胞增殖和新陳代謝廢物的排除[10]。