李育強，智倩倩△，王曉麗，王南南，韓超，孔曉穎

(1.青島明藥堂醫(yī)療股份有限公司，青島 266111；2.青島農(nóng)業(yè)大學，青島 266109)

1 引 言

據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年統(tǒng)計，全球約有140萬院內(nèi)感染患者。院內(nèi)感染[1]將成為全球性日益嚴重的公共衛(wèi)生問題?？刂圃簝?nèi)感染的有效途徑是在醫(yī)療器械表面添加涂層。國外先進技術通過光催化接枝的方法將超滑、抗菌涂層接枝到醫(yī)療器械表面，而國內(nèi)尚無此技術。為降低腔道插管造成的組織感染，同時面對國際市場的技術壟斷[2-3]，國內(nèi)科研工作者對功能性涂層也加大了研究力度。目前臨床醫(yī)療器械的抗菌成分多為納米銀，但研究表明納米銀會隨大鼠血液循環(huán)進入腎臟、肝臟、脾臟、大腦和肺臟等重要器官內(nèi)，并在細胞內(nèi)外沉積，干擾細胞[4]。同時在國家對含銀醫(yī)療器械產(chǎn)品不予注冊的背景下，亟需研制一種對人體無毒害、無抗藥性的超滑抗菌涂層導管。

我們經(jīng)過對光催化接枝涂層的研究，深入探討關鍵技術要點，包括單體濃度、體系溫度、紫外接枝時間等，探索最佳制備工藝，制備出新型的硅膠超滑抗菌涂層[5]。本研究以導尿管為例，對新型超滑抗菌涂層進行生物安全性能研究。細胞毒性試驗[6]是公認的可迅速地表征供試品對細胞新陳代謝的影響，其結果可直接反應超滑抗菌導尿管是否安全可靠。按照《GB/T 16886醫(yī)療器械生物學評價》，超滑抗菌導尿管屬于黏膜接觸類產(chǎn)品，通過細胞毒性、黏膜刺激和皮下刺激等進行生物安全性能評價試驗。

2 材料與方法

2.1 新型超滑抗菌涂層的制備

選用純硅膠導尿管為基體材料，采用光催化接枝的方法制備出超滑抗菌硅膠導尿管[5]。將導尿管經(jīng)過丙酮預處理、醇洗、干燥、光催化劑處理、紫外接枝反應、醇洗、水洗等工序，將丙烯酸及牡丹酚接枝到導尿管外表面制備出超滑抗菌涂層導尿管。

2.2 單因素分析

設計單因素試驗方案見表1，從單體濃度、體系溫度及紫外輻照時間考察涂層的外觀、厚度、體系反應現(xiàn)象等，優(yōu)化涂層工藝。

表1 單因素試驗方案

2.3 產(chǎn)品表征

2.3.1紅外光譜 采用美國尼高力公司的傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet 510p對樣品結構進行分析，評價涂層接枝結果。

2.3.2掃描電鏡 采用掃描電子顯微鏡S-3400N進行掃描分析樣品形貌及涂層厚度。

2.4 MTT法[6]

用DMEM完全培養(yǎng)液按照1∶5比例浸提超滑抗菌導尿管。取小鼠成纖維細胞L929細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，細胞鋪板濃度為4.5×104個/孔，放置于CO2培養(yǎng)箱(5%，37℃)培養(yǎng)18 h。棄除細胞培養(yǎng)液，分別將100 μL DMEM 完全培養(yǎng)基、高密度聚乙烯 DMEM 培養(yǎng)基、含5%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基、兩組樣品浸提液加到每個孔中，每組5孔平行樣。

培養(yǎng)72 h后取出培養(yǎng)板，鏡下觀察細胞形態(tài)。每孔加10 μL MTT，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，用酶標儀測OD570nm的吸光度(A)值。計算得出平均A值，并計算細胞的相對增殖率(RGH)：RGH=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。細胞毒性分級：0級，RGH≥100%；1級，RGH為75%～99%；2級，RGH為50%～74%；3級，RGH為25%～49%；4級，RGH為1%～24%；5級，RGH為0。

2.5 皮下刺激實驗

取10只新西蘭兔，試驗前4～18 h，徹底除去動物背部脊柱兩側(cè)背毛。分別用無菌生理鹽水、無菌棉籽油浸提取超滑抗菌導尿管。每只兔子背部兩側(cè)各選取8個注射點，左前側(cè)四點為無菌生理鹽水浸提液；左后側(cè)四點為無菌生理鹽水對照液；右前側(cè)四點為無菌棉籽油浸提液；右后側(cè)四點為無菌棉籽油對照液。每個注射點注射0.2 mL液體，并在注射后24、48和72 h觀察各注射部位狀況。根據(jù)國際標準化組織(ISO)制定的《醫(yī)用器械生物學評價和國際標準》(ISO10993：2002)評分標準對注射點進行評分，判斷皮下刺激分數(shù)。

2.6 黏膜刺激實驗[7]

取6只新西蘭兔，4只為實驗組(2雄2雌)，2只為對照組(1雄1雌)。將兔固定，提起兔尾巴使其陰道口/陰莖完全暴露，使用注射器，將1 mL浸提液，推入實驗組新西蘭兔陰道/陰莖內(nèi)，用無菌脫脂紗布輕輕擦去溢出物，給藥后使動物維持臀高頭低位被動安靜3 min。每隔24 h重復給藥7 d后，無痛處死新西蘭兔后，取生殖道組織做HE染色病理檢查，觀察有無組織變性、壞死、炎細胞浸潤、血管充血、水腫等刺激性反應并打分評價。

2.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異。P<0.05(*)為有顯著性差異，P<0.01(**)為有極顯著性差異。

3 結果

3.1 單體濃度

對比分析涂層表面微觀及厚度優(yōu)化單體濃度，結果見圖1。根據(jù)結果可知，涂層厚度隨單體濃度的增高先增加后降低，但單體濃度過高使涂層表面變得粗糙。推測原因：當單體濃度較低時，單體之間接觸和碰撞的幾率較小，不利于分子鏈的增長，聚合反應慢，涂層較??；隨單體濃度的提高，反應速度加快，利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加；但單體濃度過高時，反應體系升溫過快，不利于熱量散發(fā)，聚丙烯酸易發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，涂層表面出現(xiàn)結塊。單體濃度優(yōu)化為95 mM。

圖1單體濃度對涂層厚度的影響

Fig1Theinfluenceofmonomerconcentrationonthecoatingthickness

3.2 體系溫度

針對體系溫度單因素，分析涂層厚度及體系反應前后變化，結果見圖2。根據(jù)結果可知，涂層厚度隨體系溫度的升高先增加后減小，但溫度過高使反應體系黏度大大增加。體系反應溫度升高利于反應速度加快，有利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加；但體系溫度過高時，丙烯酸容易發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象，使得反應體系黏度增加，不利于體系的重復利用。體系溫度優(yōu)化為35℃。

3.3 紫外輻照時間

通過涂層厚度及試樣性狀優(yōu)化紫外輻照時間，結果見圖3。根據(jù)結果可知，涂層厚度隨紫外接枝時間增加而增加，但涂層厚度過高造成試樣透明度降低，影響外觀。紫外輻照下產(chǎn)生自由基，輻照時間越長，產(chǎn)生的自由基數(shù)量越多，利于分子鏈的增長，相對分子質(zhì)量增大，涂層厚度增加。紫外輻照時間優(yōu)化為7 min。

圖2體系溫度對涂層厚度的影響

Fig2Influenceofsystemtemperatureoncoatingthickness

圖3紫外輻射時間對涂層厚度的影響

Fig3Effectofultravioletradiationtimeoncoatingthickness

3.4 產(chǎn)品表征

2.4.1紅外圖譜 對超滑抗菌導尿管進行紅外光譜分析，如圖4紅外光譜圖對比所示，硅膠導尿管基材的特征峰包含788、1008、1258、2962 cm-1等，對比超滑涂層及超滑抗菌涂層導尿管可知，超滑涂層、抗菌涂層分別成功地引入特征峰1543、1716 cm-1，其中1716 cm-1是抑菌劑中酯基C=O雙鍵伸縮振動峰，說明超滑涂層及抑菌涂層均成功接枝到導尿管表面。

圖4 裸管、超滑導尿管、超滑抗菌導尿管紅外光譜圖

Fig4Infraredspectraofsiliconetube,superslidecatheter,superslideantibacterialcatheter

2.4.2掃描電鏡 圖5為單因素試驗導尿管涂層表面及橫截面的掃描電鏡照片，對各試驗條件下樣品的表觀及涂層厚度進行分析。圖中，A-E表示不同單體濃度下制備的涂層表面照片，涂層表面隨單體濃度的增加，涂層表面由緊密平整逐漸呈現(xiàn)水流狀；濃度過高時，涂層表面出現(xiàn)結塊、不平整的現(xiàn)象。F-J、K-O分別為不同體系溫度及紫外輻射時間下導管橫截面照片，根據(jù)結果可以看出涂層厚度均隨體系溫度、紫外輻射時間的增加而增加。

圖5單因素試樣掃描電鏡照片

(A-E：不同單體濃度涂層表面；F-J：不同體系溫度導管橫截面；K-O：不同紫外輻射時間導管橫截面)

Fig5Scanningelectronmicrographesofsinglefactorsample

3.5 細胞毒性

新型超滑抗菌導尿管組浸提液細胞相對增殖率為94.9%～102.0%，無涂層硅膠導尿管細胞相對增殖率為97.2%～103.2%，細胞毒性均為1級。超滑抗菌導尿管與對照普通硅膠導尿管的相對增殖率平均值間的差異無顯著性意義(P<0.05)。各組細胞相對增殖率平均值見圖6。

圖6各組體外細胞相對增值率(RGH)

Fig6Cellrelativeproliferationrateofdifferentgroup

3.6 皮下刺激

皮下刺激24、48和72 h后，觀察實驗組和對照組，精神狀態(tài)良好，無異常情況發(fā)生。整個觀察期間實驗組注射點無紅斑、無水腫、無硬結，超滑抗菌導尿管皮下刺激分數(shù)為0。

3.7 黏膜刺激

見圖7，超滑抗菌導尿管重復給毒7 d，對生殖道黏膜無刺激，給藥部位未出現(xiàn)糜爛、潰瘍等病變，對照組和實驗組組織正常，均未出現(xiàn)炎癥反應。

圖7兔子生殖道切片照片(400×)

Fig7Themicroscopeimagesofrabbittractusgenitalissection(400×)

4 討論

面對國內(nèi)外市場上含銀制品的潛在毒性，及近年來國家對含銀醫(yī)療器械監(jiān)管力度的加大，亟需對高生物安全性的超滑抗菌涂層材料進行研究。市場上的含銀涂層導尿管直接與人體黏膜接觸，其細胞毒性較高[8]，將對機體細胞造成不可彌補的隱患。

牡丹酚來源于毛茛科植物牡丹皮，蘿藦科植物等，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌等作用，尤其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌效果，此外，牡丹酚可被人體迅速吸收、代謝和排泄[9]。課題組前期對硅膠光催化接枝牡丹酚涂層的體外抑菌實驗效果顯著，制備成超滑抗菌導尿管后，其持續(xù)抗菌時間可達30 d以上[5]，可顯著降低插入導管相關性院內(nèi)感染。

我們對光催化接枝涂層進行研究，深入探討關鍵工藝技術，包括單體濃度、體系溫度、紫外接枝時間。同時參考GB/T 16886.5-2017第5部分[10]、GB/T 16886.10-2005 第10部分[11]，對光催化接枝制備的超滑抗菌導尿管進行了生物學評價。研究了新型超滑抗菌導尿管的體外細胞毒性、皮下刺激以及黏膜刺激。體外細胞毒性MTT實驗法[8]通過檢測產(chǎn)品對活細胞數(shù)量及其新陳代謝的影響進行評價，能快捷地反映產(chǎn)品對細胞造成的損害程度。新型超滑抗菌導尿管體外細胞毒性與普通導尿管相對增值率平均值間差異無顯著性意義(P>0.05)，細胞毒性級別均為1級。皮下刺激72 h后，實驗組注射點無紅斑、無水腫、無硬結。黏膜刺激試驗能反映出導尿管對黏膜腔道組織的潛在性刺激[7]。本研究試驗中對動物重復給毒7 d后，超滑抗菌導尿管浸提液對黏膜無刺激，無炎癥現(xiàn)象出現(xiàn)，表明新型導尿管超滑抗菌涂層在使用過程中對黏膜無潛在性危害。

綜上，本研究超滑抗菌涂層優(yōu)化工藝分別為95 mM、35℃、7 min，其細胞毒性為1級，皮下刺激評分為0分，陰道刺激實驗中，重復給毒7 d后對陰道黏膜無刺激，生物安全性良好，符合醫(yī)療器械生物學評價標準要求。超滑抗菌涂層完全可以替代含銀涂層器械，為其臨床使用提供理論依據(jù)。該涂層技術不僅用于高端涂層導管系列產(chǎn)品，如氣管插管、胃管、引流管、留置針套管等，而且也可用于骨科植入器械、牙科植入器械和呼吸機等醫(yī)療設備，帶動高端醫(yī)療器械產(chǎn)品的開發(fā)。