王麗麗，黃慶利

(1. 徐州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，徐州 221004；2. 徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，徐州 221004)

1 引 言

石墨烯(graphene)作為一種sp2雜化的新型二維碳納米材料[1-2]，由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，原料易得，價格低廉，被普遍應(yīng)用于生物傳感器、化學(xué)儲能、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域[2-3]。石墨烯的氧化產(chǎn)物氧化石墨烯(graphene oxide，GO)，相比之下具有較高的比表面積，豐富的含氧活性官能團(tuán)(如-OH，-COOH)等特點(diǎn)，近年來越來越多的被作為基因和抗癌藥物載體[4-9]。然而，氧化石墨烯存在動物和細(xì)胞毒性、在生理溶液中易聚集難分散等不足[2,6]，很多課題組已對其進(jìn)行表面修飾以改善石墨烯復(fù)合材料的生物相容性及控制其體內(nèi)循環(huán)運(yùn)行[7，10-11]。

本研究分別以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)、氨基-β-環(huán)糊精(β-CDs)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為修飾劑[12-13]，通過水熱法[14-15]合成了3種不同修飾分子的石墨烯材料。然后通過透射電子顯微鏡(TEM)、紅外光譜(FIIR)、表面電勢(Zeta)等手段對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行表征，并且通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)對其體外細(xì)胞相容性進(jìn)行了探究。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同功能基團(tuán)修飾的石墨烯材料對Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞具有不同的生物相容性。其中GO-APS生物相容性較差，GO-BSA生物相容性最好，該研究為后續(xù)進(jìn)一步功能化修飾及其成為理想的藥物載體打下基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑 石墨烯分散液(2 mg/mL，南京先豐納米科技有限公司)；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；全氨基-脫氧β-環(huán)糊精(β-CDs，山東濱州智源生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(BSA，BIOSHARP生物公司)；DMEM培養(yǎng)基(江蘇凱基生物技術(shù)股份公司)；PBS緩沖液(江蘇凱基生物技術(shù)股份公司)；胰酶細(xì)胞消化液(微科曼得生物工程有限公司)；CCK-8試劑盒(微科曼得生物工程有限公司)。

2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；磁力攪拌器(江蘇天由有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；Zeta電位儀(美國PSS公司)；三氣培養(yǎng)箱(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；生物安全柜(香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；臺式低速離心機(jī)(德國艾本德股份有限公司)；多功能微孔板檢測儀(基因有限公司)。

2.1.3細(xì)胞系 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素和90% DMEM培養(yǎng)基中，放置在37 ℃，CO2濃度為 5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，1～2 d更換培養(yǎng)基。

2.2 功能化氧化石墨烯材料GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的制備

取15 mL 2 g/L GO水溶液加入30 mL去離子水，超聲0.5～1 h使其分散至均勻。隨后取標(biāo)號為①②③的三個反應(yīng)釜，分別向每個釜加入15 mL GO分散液。在磁力攪拌下，分別向①號釜加入0.2 mL APS，向②號釜加入50 mg β-CD，向③號釜加入100 mg BSA,常溫下攪拌30 min，進(jìn)行活化反應(yīng)。接著，將裝有反應(yīng)液的反應(yīng)釜放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)，100℃，反應(yīng)6 h后停止，使其自然冷卻至室溫。

產(chǎn)物用超純水和乙醇分別離心洗滌3次，加超純水稀釋，配制得到濃度均為400 μg/mL的三種改性氧化石墨烯復(fù)合材料，4℃放置備用。

2.3 材料的表征與測試

2.3.1透射電子顯微鏡(TEM)測試 將樣本GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA配置成低濃度溶液，分別滴在銅網(wǎng)上，自然晾干后，用透射電子顯微鏡對其進(jìn)行拍攝，以觀察修飾前后氧化石墨烯的整體形貌變化。

2.3.2電勢分析(Zeta)測試 將GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA固體利用NaBr壓片，利用紅外光譜儀進(jìn)行測試。

2.4 材料的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

(1)將培養(yǎng)良好的Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞(3～5×105個)經(jīng)過消化并離心處理后，加入含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的新鮮DMEM培養(yǎng)液中。按每孔100 μL(5～8×103的細(xì)胞密度)細(xì)胞懸液將其分散在96孔板中(最外圍一圈孔板不使用)，隨后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

(2)待細(xì)胞貼壁生長后，吸掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，接著每孔加入100 μL含不同濃度的GO，GO-APS，GO-CDs和GO-BSA的新鮮培養(yǎng)液。這四種材料均有4個不同濃度，分別為20、40、80和160 μg/mL，每種材料和細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)相同時間，均為24 h。

(3)吸掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液和90 μL DMEM培養(yǎng)液，每種材料和細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)相同時間，均為1 h。用酶標(biāo)儀檢測各個孔在450 nm處吸光值(A)。

(4)實(shí)驗(yàn)均以不加任何材料處理的細(xì)胞作對照組，每組數(shù)據(jù)來自5個平行樣本。

細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組- OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%

OD實(shí)驗(yàn)組為材料處理細(xì)胞后，在96孔板中利用酶標(biāo)儀上所得吸光值， OD空白為未加細(xì)胞，只有培養(yǎng)液和CCK溶液的吸光值(修飾后的GO對450 nm處吸光值無影響)，OD對照組為不加任何材料、只有細(xì)胞和培養(yǎng)液的吸光值。且OD值均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Origin 8.5軟件作圖。

3 結(jié)果和討論

3.1 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的透射電鏡結(jié)果

不同修飾分子修飾的GO形貌上會發(fā)生一定變化。為了研究3種修飾分子在GO表面的修飾情況，我們利用透射電子顯微鏡對樣品進(jìn)行了表征[16]。圖1是未修飾的GO和不同分子修飾的GO的透射電子顯微鏡照片，從圖1A中我們發(fā)現(xiàn)，未修飾的GO為透明的薄片狀結(jié)構(gòu)，有明顯褶皺存在。當(dāng)APS修飾后，其整體結(jié)構(gòu)不變，但透明度略有降低，這主要是APS分子量較小導(dǎo)致其表面變化不明顯，見圖1B。BSA修飾后，見圖1C,GO明顯變得基本不透明，有一層糊狀物質(zhì)覆蓋在GO表面，這主要是BSA作為蛋白其可以通過靜電吸附等作用結(jié)合在GO表面。而當(dāng)環(huán)糊精CD修飾后，由于我們所用環(huán)糊精表面含有氨基使其能夠連接到GO表面，見圖1D，在GO表面我們也發(fā)現(xiàn)CD覆蓋。

A.氧化石墨烯；B.乙氧基硅烷修飾氧化石墨烯；C.牛血清蛋白修飾氧化石墨烯；D.環(huán)糊精修飾氧化石墨烯

圖1GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA透射電鏡圖

Fig1TransmissionelectronmicrographsofGOandGO-APS,GO-CDsandGO-BSA

3.2 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的紅外光譜結(jié)果

紅外光譜可以用來檢測材料微觀結(jié)構(gòu)的變化及存在的界面相互作用[16]。GO、 GO-APS、GO-CDs和 GO-BSA的紅外光譜見圖2。圖中1633 cm-1和1380 cm-1處為芳基羧酸中-COOH的特征吸收峰。當(dāng)APS修飾后，其峰位位移到1508 cm-1和1269 cm-1處，主要是APS修飾后，GO化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變從而導(dǎo)致其特征峰位移。同樣的道理，當(dāng)CD和BSA修飾后，其峰位置也明顯發(fā)生改變，說明CD和BSA成功修飾[17]，這與前面透射電子顯微鏡的結(jié)果相一致。

圖2 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA紅外光譜圖

3.3 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的Zeta電位結(jié)果

為了進(jìn)一步研究各種修飾劑的修飾情況，我們通過Zeta電位儀測試各個樣品的Zeta電位，見圖3。結(jié)果表明GO的Zeta電位為負(fù)值。但當(dāng)修飾了環(huán)糊精后其電位變成了正值，而修飾APS和BSA后，其Zeta電位為負(fù)值，雖然依然為負(fù)值，但其數(shù)值明顯較純GO的Zeta電位更低，這和這些修飾分子本身的特性有關(guān)。通過Zeta電位研究，進(jìn)一步證明了3種分子成功修飾到了GO表面，我們可以根據(jù)后續(xù)工作的需要選擇不同的修飾分子。

圖3 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的Zeta電位圖

3.4 GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的體外細(xì)胞相容性

生物安全性是納米材料作為藥物載體的重要條件之一，因此我們對合成材料GO、GO-APS、GO-CDs和GO-BSA進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測，CCK-8結(jié)果見圖4。從圖中大體走向趨勢可以看出，細(xì)胞毒性具有一定的濃度依賴性[18-22]，隨著四種材料液濃度的增加，細(xì)胞的存活率都有一定程度的下降，細(xì)胞毒性增加，而且結(jié)果均為GO-BSA細(xì)胞毒性< GO-CDs細(xì)胞毒性< GO-APS細(xì)胞毒性。

根據(jù)細(xì)胞毒性分級指標(biāo)劃歸，在MDA-MB-231細(xì)胞的試驗(yàn)(圖4a)中，GO不但對細(xì)胞無毒性作用，甚至有微弱促進(jìn)細(xì)胞生長的效果；GO-APS在濃度達(dá)40 μg/mL時，已經(jīng)具有微弱的細(xì)胞毒性；GO-CDs在濃度達(dá)80 ug/mL時，具有輕微的細(xì)胞毒性；然而GO-BSA即使在最高濃度 160 μg /mL 條件下，仍無明顯的細(xì)胞毒性，存活率在85%以上。在Hela細(xì)胞的試驗(yàn)(圖4b)中，APS修飾的GO甚至比GO具有更高的細(xì)胞抑制率，β-CD和BSA修飾后的GO，細(xì)胞毒性有明顯減小。各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上所述，納米石墨烯的細(xì)胞毒性和細(xì)胞種類有一定關(guān)系[20-22]， GO-APS即使在低濃度(20 μg /mL)對Hela細(xì)胞都有明顯毒性，而GO-CDs和GO-BSA在100 μg /mL以內(nèi)，基本對兩種細(xì)胞均無毒性。因此，GO-CDs和GO-BSA可以作為藥物載體的優(yōu)先選擇。

圖4 GO和GO-APS、GO-CDs和GO-BSA的細(xì)胞相容性結(jié)果

Fig4CellularcompatibilityresultsofGOandGO-APS,GO-CDs,andGO-BSA

4 結(jié)論

我們首先采用水熱法一步合成了官能化修飾的氧化石墨復(fù)合納米材料。通過透射電子顯微鏡、紅外光譜和zeta電位表征，這些分子被成功修飾到GO表面。同時我們還研究了這些修飾后的GO的細(xì)胞相容性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同修飾材料具有不同的生物相容性。其中CD和BSA修飾的GO基本無生物毒性。這將為進(jìn)一步拓寬石墨烯功能化復(fù)合納米材在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。