田 芬,武慧姣,謝富康*,李朝紅*

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,中國湖南長沙410008;2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,中國廣東廣州510080)

促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。該信號(hào)通路有3個(gè)主要的家族成員,分別為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ER-K1/2)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38。MAPKs信號(hào)通路能夠參與調(diào)控多種癌細(xì)胞增殖、分化及凋亡等重要的生物學(xué)反應(yīng)[1～2]。其中,ERK1/2信號(hào)通路能夠介導(dǎo)不同胞外刺激調(diào)控癌細(xì)胞凋亡[2～5],然而其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的致死性腫瘤,約占所有顱內(nèi)腫瘤的40%[6]。膠質(zhì)瘤多呈彌漫性和侵潤性生長,與正常腦組織邊緣分不清,具有高發(fā)病率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和低治愈率等特點(diǎn)。雖然目前臨床仍以手術(shù)方法為主治療膠質(zhì)瘤,但是由于腦功能的特殊性,化療在膠質(zhì)瘤治療中起著越來越重要的作用。現(xiàn)已證實(shí)術(shù)后化療能延長患者的生存時(shí)間和提高患者的生存率[7～8]。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)即三苯氧胺,為非固醇類三苯乙烯衍生物,是強(qiáng)有力的雌激素受體(estrogen receptor,ER)拮抗劑,廣泛應(yīng)用于ER陽性的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn),TAM也能用于ER陰性的腫瘤化療,其中包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9～10]。越來越多的研究表明TAM能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[11～12],然而其具體的分子作用機(jī)制尚不明確。

本研究以C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察MAPKs信號(hào)通路活化對(duì)TAM所致C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用,初步探討TAM誘導(dǎo)C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為TAM作為膠質(zhì)瘤的輔助性化療用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院黃文林教授惠贈(zèng);TAM、MTT、DAPI、PD9-8059和瓊脂糖購自美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶購自美國Gibco公司;RIPA裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;BCA法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Millipore公司;DNA抽提試劑盒購置北京天根生化科技有限公司;兔抗p-ERK1/2、兔抗ERK1/2和兔抗β-actin購自Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 MTT檢測(cè)

將復(fù)蘇后的C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期,胰酶消化并制備細(xì)胞懸液;將200 μL C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液(含2×103個(gè)細(xì)胞)加入96孔板中,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行以下分組處理。實(shí)驗(yàn)組：用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋4 000 μmol/L TAM母液至終濃度為 1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L的TAM工作液;陰性對(duì)照組(NC組)：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入等體積的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。將分組細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h,隨后每孔加入20 μL MTT溶液,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去帶MTT溶液的培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO,搖床輕微振蕩10 min,于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定其吸光度值(OD值)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)

取處于對(duì)數(shù)生長期的C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(內(nèi)含爬片)中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行以下分組處理。實(shí)驗(yàn)組：用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋4 000 μmol/L TAM母液至終濃度為1 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L 的 TAM 工作液;陰性對(duì)照組(NC組)：細(xì)胞培養(yǎng)基中加入等體積的DMSO。將分組細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出爬片,PBS緩沖液洗兩遍;4%多聚甲醛固定10 min,吸去固定液,PBS緩沖液洗兩遍;加入DAPI染色液室溫避光孵育10 min,PBS緩沖液洗兩遍,隨后加甘油封閉并置于熒光顯微鏡下觀察C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞核的形態(tài)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)1μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L TAM 溶液處理 24 h 或經(jīng)PD98059預(yù)處理15 min再用30 μmol/L TAM溶液作用24 h后,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。吸取1 mL細(xì)胞懸液(約1×105個(gè)細(xì)胞),離心去上清液,先加入195 μL Annexin VFITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,隨后再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻;加入10 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI),輕輕混勻,室溫避光孵育20 min后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 Western-blot檢測(cè)ERK1/2的活化

C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)30 μmol/L TAM作用 5 min、15 min、30 min、60 min,或經(jīng) PD98059預(yù)處理15 min再用30 μmol/L TAM作用24 h,隨后收集細(xì)胞。用含有蛋白酶磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞總蛋白質(zhì),然后采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)樣本變性處理后,以每孔40 μg上樣,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶室溫封閉60 min,隨后加入相應(yīng)一抗,4℃孵育過夜;次日,用TBST漂洗3次,每次10 min,然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,漂洗后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,暗室曝光到X光膠片上。采用凝膠成像系統(tǒng)拍攝,并使用Gene Genius Bioimaging System對(duì)所存圖像進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多樣本間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAM能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性

不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞12 h、24 h和48 h后,采用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活性。結(jié)果顯示,隨著TAM濃度增加和作用時(shí)間延長,細(xì)胞活性逐漸被抑制,并呈濃度和時(shí)間依賴性。1～40 μmol/L TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞12 h、24 h和48 h后,C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值分別是 39.78 μmol/L、29.48 μmol/L、16.05 μmol/L,U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的IC50值分別是45.45 μmol/L、30.72 μmol/L、21.41 μmol/L(圖 1A)。另外,隨著30 μmol/L TAM處理時(shí)間的延長,細(xì)胞逐漸變圓、皺縮,細(xì)胞貼壁特性也逐漸喪失,并出現(xiàn)細(xì)胞漂浮現(xiàn)象(圖 1B)。

2.2 TAM能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

我們通過DAPI染色法和Annexin V-FITC/PI染色法來確定TAM是否能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞核完整并被染成均一的淡藍(lán)色;不同濃度的TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后,細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的凋亡形態(tài)特征,表現(xiàn)為核大小不一、固縮、碎裂、染色增強(qiáng),且其凋亡呈濃度依賴性(圖 2)。

Annexin V-FITC/PI染色法實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明,與對(duì)照組相比,20～30 μmol/L TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后其凋亡率明顯增高并呈濃度依賴性,而10 μmol/L TAM組的凋亡率未見明顯增高(圖3)。以上結(jié)果提示TAM能夠明顯地誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

2.3 TAM能增加ERK1/2磷酸化水平

我們采用 Western-blot檢測(cè)經(jīng) 30 μmol/L TAM處理不同時(shí)間后C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ERK1/2磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TAM處理15 min時(shí),ERK1/2磷酸化水平顯著增高(P＜0.05),但在接下來的15 min內(nèi),其磷酸化水平迅速下降,然后隨著TAM處理時(shí)間延長,其磷酸化水平又略有上升趨勢(shì)(圖4)。此結(jié)果表明TAM在短時(shí)間內(nèi)能夠激活ERK1/2信號(hào)通路。

2.4 ERK1/2抑制劑能降低TAM所致ERK磷酸化水平增高

我們采用ERK1/2抑制劑(PD98059)預(yù)處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞15 min,隨后加入30 μmol/L TAM處理24 h,然后采用Western-blot檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,PD9-8059單獨(dú)處理組中的ERK1/2磷酸化水平明顯下調(diào)(P＜0.05),而TAM單獨(dú)處理組中的ERK1/2磷酸化水平明顯升高(P＜0.05);PD98059+TAM組與TAM單獨(dú)處理組相比,ERK1/2磷酸化水平顯著降低(P＜0.05,圖5)。以上結(jié)果提示,PD98059對(duì)TAM所致的ERK1/2磷酸化水平增高有明顯的抑制作用。

2.5 抑制ERK1/2信號(hào)通路能增加TAM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

為了探討ERK1/2信號(hào)通路在TAM所致C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用,我們采用PD98059預(yù)處理細(xì)胞15 min,隨后加入30 μmol/L TAM處理24 h,然后用Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)其細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PD98059單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率未見明顯變化,而TAM單獨(dú)處理組的細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.05);PD98059與TAM聯(lián)合處理比TAM單獨(dú)處理的細(xì)胞凋亡率更高(P＜0.05,圖6)。由此說明ERK1/2信號(hào)通路參與介導(dǎo)TAM誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

圖1 TAM對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響(A)C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度TAM作用12 h、24 h和48 h后,細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)分析;(B)C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)30 μmol/L TAM作用12 h、24 h和48 h后,細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。*表示與NC組相比,P＜0.05。Fig.1 Effect of TAM on glioma cell viability(±s,n=3)(A)Statistical analysis of survival rates of C6 and U87MG glioma cells treated with various concentrations of TAM for 12 h,24 h and 48 h;(B)The morphological observation of C6 and U87MG glioma cells treated with 30 μmol/L TAM for 12 h,24 h and 48 h.*Compared with NC group,P＜0.05.

圖2 不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果Fig.2 The morphological observation of nuclei of C6 and U87MG glioma cells treated with various concentrations of TAM for 24 h

3 討論

越來越多的研究表明,多種信號(hào)通路參與調(diào)控TAM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和耐藥性[13～14]。本研究表明,TAM能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和激活ERK1/2信號(hào)通路;ERK抑制劑能與TAM共同作用,促進(jìn)TAM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度TAM處理C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h對(duì)其凋亡水平的影響*與 NC 組相比,P＜0.05。Fig.3 Effects of various concentrations of TAM on the apoptosis of C6 and U87MG glioma cells after treatment for 24 h(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05.

圖5 TAM和PD98059聯(lián)合作用對(duì)ERK1/2磷酸化的影響*與 NC 組相比,P＜0.05;#與 TAM 組相比,P＜0.05。Fig.5 Effect of TAM and PD98059 on phosphorylation of ERK1/2 in C6 and U87MG glioma cells after treatment for 24 h(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05;#Compared with TAM group,P＜0.05.

圖6C6和U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)TAM和PD98059聯(lián)合作用后的凋亡水平*與 NC 組相比,P＜0.05;#與 TAM 組相比,P＜0.05。Fig.6 The apoptosis of C6 and U87MG glioma cells co-treated with TAM and PD98059(±s,n=3)*Compared with NC group,P＜0.05;#Compared with TAM group,P＜0.05.

TAM作為抗腫瘤藥物,現(xiàn)已被應(yīng)用于ER陽性的乳腺癌的治療,臨床上能顯著改善患者預(yù)后[15]。其主要作用機(jī)制是,通過與天然雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體阻斷雌激素誘導(dǎo)的增殖信號(hào),從而抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn),TAM也能通過ER非依賴的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種非激素依賴性腫瘤,TAM對(duì)該腫瘤的作用一般是經(jīng)ER非依賴的途徑來實(shí)現(xiàn)。相關(guān)的體內(nèi)外研究表明,TAM能阻礙膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長,并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn),TAM能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性(圖1),提高細(xì)胞的凋亡率(圖2、圖3),并伴隨著ERK1/2磷酸化水平增加(圖4）。

ERK1/2屬于MAPKs家族成員之一,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分為ERK1和ERK2兩種類型。在細(xì)胞靜息狀況下,ERK處于胞漿內(nèi),一旦受到一些生長因子、藥物等生物因素或放射線、高溫高壓等物理因素的激活,會(huì)迅速地穿過核膜進(jìn)入核內(nèi),并激活下游轉(zhuǎn)錄因子,從而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道,ERK1/2信號(hào)通路在骨肉瘤、食道癌、卵巢癌、乳腺癌等多種惡性癌細(xì)胞中可被各種機(jī)制所激活,從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[18～21],提示ERK1/2信號(hào)通路在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起到至關(guān)重要的作用。同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)研究表明,ERK1/2信號(hào)通路的活化能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖[22]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PD98059(ERK1/2抑制劑)能增加TAM誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡(圖5、圖6)。然而,這一結(jié)論與TAM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和增加ERK磷酸化水平的結(jié)果(圖2～4)似乎相矛盾。我們分析可能是由于TAM能在短時(shí)間內(nèi)快速激活ERK,反應(yīng)性保護(hù)細(xì)胞,抑制其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用;但是隨著TAM濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)其他促凋亡信號(hào)途徑將被激活,這些促凋亡信號(hào)途徑逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究表明MAPKs家族中ERK1/2信號(hào)通路的激活參與了TAM對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,為TAM治療膠質(zhì)瘤提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。