馬翼龍,李 鐵,呂麗娜,耿軼釗*,紀 青*

(河北工業(yè)大學(xué)a.生物物理研究所;b.理學(xué)院;c.省部共建電工裝備可靠性與智能化國家重點實驗室;d.電氣工程學(xué)院,中國天津300401)

驅(qū)動蛋白是一種普遍存在于真核生物細胞中的馬達蛋白,能夠與微管蛋白特異性結(jié)合并沿著微管定向連續(xù)行走,將尾部所攜帶的細胞器或大分子貨物輸送到細胞中的指定位置[1～3]。驅(qū)動蛋白又是一種核苷酸酶,能夠催化ATP分子水解,將ATP分子攜帶的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為沿微管定向行走的機械能[4]。驅(qū)動蛋白種類非常多,可以分為14個亞家族[5～6],本文主要討論最常見的以二聚體形式沿微管正方向連續(xù)行走的驅(qū)動蛋白[7～8]?，F(xiàn)在已知驅(qū)動蛋白主要的發(fā)力做功過程涉及的構(gòu)象變化是連接其馬達結(jié)構(gòu)域(motor domain,頭部)的由十幾個氨基酸組成的頸鏈向驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域?qū)拥倪^程[9]。此過程發(fā)生在二聚體中處于行走方向前方的驅(qū)動蛋白頭部,可以將后面的頭部帶到其下一個微管結(jié)合位點,以這種方式,驅(qū)動蛋白行走一步[7,10～15]。但是,頸鏈的對接過程無法自發(fā)發(fā)生,需要ATP分子與此驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合,即需要消耗一個ATP分子。所以,ATP分子與驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是驅(qū)動蛋白能量轉(zhuǎn)化和力產(chǎn)生過程的起始步驟[9]。ATP分子與驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點的結(jié)合所產(chǎn)生的構(gòu)象和能量變化最終引起了頸鏈對接。但是,通過驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(圖1)可以發(fā)現(xiàn),驅(qū)動蛋白的核苷酸結(jié)合位點和頸鏈分別位于馬達結(jié)構(gòu)域的兩側(cè),ATP分子的結(jié)合無法直接對頸鏈產(chǎn)生影響。所以,兩者之間必然存在著能夠傳遞力和構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)[8,16～17]。在驅(qū)動蛋白結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的研究中,一個關(guān)鍵的問題是ATP分子的結(jié)合效果如何傳遞到驅(qū)動蛋白的頸鏈部分并激發(fā)其向頭部的對接運動,也就是驅(qū)動蛋白如何將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機械能。本文結(jié)合本課題組的研究結(jié)果,分三個部分對此問題的研究進展予以綜述。

圖1 驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)圖中構(gòu)成ATP結(jié)合位點的N1、N2、N3和N4模體標(biāo)為紅色。與馬達結(jié)構(gòu)域處于對接狀態(tài)的頸鏈用綠色表示。ATP分子和Mg2+用球棍模型表示。Fig.1 The structure of kinesin motor domainThe ATP binding site motifs N1,N2,N3 and N4 are colored in red.The neck linker connected to motor domain is colored in green.The ATP molecule and Mg2+ion are shown in balland-stick models.

1 ATP分子與驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點的相互作用

核苷酸酶的核苷酸結(jié)合位點都是高度保守的。Sablin等[18～19]對驅(qū)動蛋白、肌球蛋白和G蛋白的核苷酸結(jié)合位點進行了系統(tǒng)研究,認為它們都是由同一個祖先蛋白質(zhì)進化得到的。與肌球蛋白和G蛋白相同,驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點也包含4個模體(motif)：N1,也叫做P-loop;N2,也叫做switch-Ⅰ;N3,也是switch-Ⅱ的一個組成部分;N4模體(圖1)[20～21]。在驅(qū)動蛋白中,N1模體主要與ATP分子的α、β磷酸基團以及和ATP分子螯合的Mg2+有相互作用;N2和N3模體主要與ATP分子的γ磷酸基團以及Mg2+有相互作用;而N4模體上的氨基酸殘基與ATP分子的嘌呤環(huán)存在疏水堆積作用,并和N1模體一起形成與嘌呤環(huán)幾何形狀匹配的疏水區(qū),對ATP分子起到穩(wěn)定作用。

ATP分子攜帶4個單位負電荷,可以與驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點產(chǎn)生特異性結(jié)合,使得體系的總能量降低。目前,相關(guān)實驗已經(jīng)確認,ATP分子與驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點結(jié)合即可誘導(dǎo)頸鏈的對接[9]。此過程不需要ATP分子水解的能量。ATP分子水解釋放的能量可能主要用來將驅(qū)動蛋白的結(jié)構(gòu)恢復(fù)到與ATP分子結(jié)合之前的狀態(tài)。ATP分子進入驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點主要促使N2和N3模體產(chǎn)生較大的構(gòu)象變化[22]。Parke等[23]根據(jù)Eg5蛋白(屬于kinesin-5亞家族)不同化學(xué)狀態(tài)的結(jié)構(gòu)對比(3HQD[23]和1II6[24]),提出了ATP結(jié)合和水解的雙水分子催化機制(two-water catalytic mechanism)。在此機制中,ATP分子進入ATP結(jié)合位點之后,N2模體的Arg234(3HQD晶體結(jié)構(gòu)殘基編號)和N3模體的Glu270之間形成鹽鍵,從而將N2和N3模體連接在一起,使ATP結(jié)合位點閉合,隔絕了外界水分子對ATP分子和ATP結(jié)合位點殘基之間相互作用的攻擊,保證了ATP分子的水解環(huán)境[23](圖2)。我們的分子動力學(xué)模擬研究發(fā)現(xiàn),驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點(N3)與微管之間有較強的相互作用,這對于穩(wěn)定ATP分子的水解環(huán)境也有非常重要的作用[25]。

在關(guān)閉的ATP結(jié)合位點內(nèi),Mg2+和ATP分子固定了兩個水分子。在ATP分子的水解過程中,一個水分子提供了水解所需的氫氧根離子,而另一個水分子則接受了第一個水分子剩余的氫離子并與Glu270產(chǎn)生相互作用,引起 Arg234和Glu270之間鹽鍵的斷裂。在此鹽鍵被破壞之后,N2和N3模體之間的結(jié)合打開,為水解產(chǎn)物磷酸基團的釋放提供了通道[23]。McGrath等[26]也用量子力學(xué)/分子力學(xué)雜交計算(QM/MM)的方法對Eg5催化的ATP分子水解過程進行了理論計算,得到了此過程中的能量轉(zhuǎn)移路徑。ATP分子水解完成之后,磷酸基團快速釋放的過程會破壞驅(qū)動蛋白殘基之間一系列的弱相互作用,從而使驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生較大的構(gòu)象變化。Nitta等[27～28]針對此問題開展了深入的研究工作,本文不再進行詳細的討論。

圖2 ATP水解的雙水分子催化結(jié)構(gòu)圖和相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中結(jié)構(gòu)取自3HQD[23]晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)晶時,核苷酸采用的是實驗條件下無法水解的ATP類似物—ANP。ANP分子、兩個水分子(W1和W2)以及相關(guān)氨基酸殘基用球棍模型顯示出來。此結(jié)構(gòu)沒有顯示氫原子。Fig.2 The two-water catalytic mechanism of ATP hydrolysis and the interaction networkThe structure is obtained from crystal structure 3HQD[23].In the crystallization,the ATP molecule is replaced by its analogue-ANP,which cannot be hydrolyzed under experimental conditions.The ANP molecule,two water molecules(W1 and W2)and related residues are shown in ball-and-stick models.The hydrogen atoms are not shown in this structure.

Hwang等[29]通過長時間的分子動力學(xué)模擬計算發(fā)現(xiàn),在ATP分子尋找其結(jié)合位點的過程中,馬達結(jié)構(gòu)域與ATP分子嘌呤環(huán)部分的疏水相互作用起主要作用。馬達結(jié)構(gòu)域上的N2模體、α0和loop5組成了一個漏斗型結(jié)構(gòu),可以捕獲ATP分子并將其帶到N1模體上。

雖然人們對ATP分子與驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點殘基之間的相互作用以及ATP分子的水解過程進行了大量的理論和實驗研究,但是,到目前為止,還有兩個關(guān)鍵的問題尚不十分清楚,即ATP分子如何在水環(huán)境中識別驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點;ATP分子通過什么路徑以何種方式進入驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點。本課題組目前正在對這兩個問題進行研究。

2 ATP分子結(jié)合引起的驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)動

根據(jù)前面的討論可知,ATP分子結(jié)合到驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點會引起相應(yīng)殘基的一系列構(gòu)象變化,主要表現(xiàn)為ATP結(jié)合腔的關(guān)閉。但是,ATP結(jié)合位點的小的構(gòu)象變化無法直接啟動驅(qū)動蛋白頸鏈向馬達結(jié)構(gòu)域的對接,必須通過馬達結(jié)構(gòu)域其他部分對ATP結(jié)合位點的構(gòu)象變化進行傳遞和放大才可以實現(xiàn)。

通過與肌球蛋白的類比,Vale等[8]提出驅(qū)動蛋白的α4螺旋(又叫switch-Ⅱ helix)可能與肌球蛋白的“relay helix”類似,在馬達結(jié)構(gòu)域的化學(xué)循環(huán)過程中像活塞連桿一樣往復(fù)運動,在不同的核苷酸結(jié)合狀態(tài)下處于不同位置。α4螺旋在ATP結(jié)合和水解過程中的位置變化可以傳遞到頸鏈,引起頸鏈向馬達結(jié)構(gòu)域的對接。但是,在不同核苷酸狀態(tài)下高分辨率的冷凍電鏡圖像以及馬達結(jié)構(gòu)域和微管復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)都表明,α4螺旋是驅(qū)動蛋白的微管結(jié)合位點[10,12,30～32]。在ATP分子結(jié)合和水解過程中,α4螺旋和微管的相對位置沒有變化,保持靜止。所以,與肌球蛋白不同,α4螺旋在驅(qū)動蛋白結(jié)合和水解ATP分子過程中并沒有大的位移。

通過對比空態(tài)和ATP結(jié)合態(tài)驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu),我們可以清楚地看到馬達結(jié)構(gòu)域在ATP分子結(jié)合的前后繞著α4存在一個轉(zhuǎn)動(圖 3)。Sindelar等[10,30,33～34]提出了從 ATP 結(jié)合位點到頸鏈的力學(xué)傳遞“蹺蹺板(seesaw)”模型(圖4)。在此模型中,馬達結(jié)構(gòu)域Asn255(使用1MKJ[10]晶體結(jié)構(gòu)殘基編號)與微管的相互作用穩(wěn)定了α4螺旋N端結(jié)構(gòu)。而整個馬達頭部是一個以α4為底面,以中心β片為板面,以α4上的Leu258、Leu261和中心β片上的Phe82、Tyr84為支點的“蹺蹺板”結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)在不同核苷酸結(jié)合態(tài)下的傾斜控制著馬達結(jié)構(gòu)域兩側(cè)ATP結(jié)合腔和頸鏈結(jié)合腔的打開與關(guān)閉。ATP分子與ATP結(jié)合腔的結(jié)合撬動了“蹺蹺板”的一端,使“蹺蹺板”向ATP結(jié)合位點一側(cè)傾斜,從而打開馬達結(jié)構(gòu)域另一端的頸鏈結(jié)合腔,使頸鏈上的Ile325進入頸鏈結(jié)合腔,啟動頸鏈對接。

最近幾年,冷凍電鏡技術(shù)分辨率的大幅提高以及馬達結(jié)構(gòu)域和微管復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)的獲得,使得人們可以更深入地從氨基酸水平討論ATP分子結(jié)合的效果如何引起驅(qū)動蛋白頸鏈的對接。比如：Moores課題組[35]和 Sindelar課題組[36]各自用冷凍電鏡方法對此問題進行了研究,而Lipowsky團隊[37]和Kaplus團隊[29]則采用分子動力學(xué)模擬的方法研究了ATP分子結(jié)合引起的驅(qū)動蛋白的構(gòu)象變化。他們的研究都提到整個馬達結(jié)構(gòu)域可以分為3個亞結(jié)構(gòu)域。ATP分子的結(jié)合可以引起亞結(jié)構(gòu)域本身的構(gòu)象變化以及亞結(jié)構(gòu)域之間的相對位移。我們也通過粗?；肿觿恿W(xué)模擬計算的方法模擬了從ATP分子結(jié)合到中心β片轉(zhuǎn)動再到頸鏈對接的整個過程,找到了幾個關(guān)鍵的中間狀態(tài)并計算出了不同狀態(tài)之間的自由能差[38]。Sindelar研究團隊也對其“蹺蹺板”模型進行了改進,提出了“彎弓”(archery bow)模型[36]。在此模型中,馬達結(jié)構(gòu)域在不同核苷酸狀態(tài)存在兩個不同的縫隙。在空態(tài),馬達結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合位點的N1模體和N2模體之間存在一個“核苷酸縫隙(nucleotide cleft)”,ATP分子可以通過此縫隙進入ATP結(jié)合位點。而ATP分子的結(jié)合會將N1模體向微管的方向拉動約4 ?的距離并與N3模體產(chǎn)生相互作用,進而使“核苷酸縫隙”關(guān)閉。此構(gòu)象變化也引起α2螺旋和中心β片的轉(zhuǎn)動,有利于N3模體和α4螺旋之間的“聚合物縫隙(polymer cleft)”打開。在此過程中,中心β片存在彎曲。N1模體和α2螺旋像弓箭的弓弦一樣,而β3和中心β片組成了弓背。在空態(tài)時,N1模體與N3模體分離,“弓”處于放松狀態(tài)。ATP結(jié)合之后,N1和N3模體之間存在相互作用,“弓”處于拉緊的狀態(tài)。而α2與N1模體之間的拉力傳遞到β4以及中心β片上,引起中心β片的扭曲和轉(zhuǎn)動,進而引起頸鏈向馬達頭部的對接。

此部分的研究是驅(qū)動蛋白能量轉(zhuǎn)換機制研究最關(guān)鍵的內(nèi)容,從實驗到理論計算方面都有大量的研究結(jié)果。但是,到目前為止,還無法從原子水平上將整個構(gòu)象變化的圖景描述清楚,尚存在非常多的細節(jié)問題,需要更深入的研究。

圖3 驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域在ATP分子結(jié)合前后的對比圖空態(tài)(ATP分子結(jié)合之前)的馬達結(jié)構(gòu)域用黃色表示,ATP結(jié)合態(tài)的馬達結(jié)構(gòu)域用紅色表示。處于非對接狀態(tài)的頸鏈用紫色表示,處于對接狀態(tài)的頸鏈用藍色表示。為了清晰地顯示中心β片繞α4螺旋的轉(zhuǎn)動,圖中隱去了驅(qū)動蛋白頭部的 α1、α2 螺旋。Fig.3 Structure comparison of motor domain before and after ATP bindingThe motor domain structure before ATP binding is presented in yellow and that after ATP binding is colored in red.The undocked neck linker is colored in purple and the docked neck linker is colored in blue.To clearly show the rotation of central β-sheet around α4,the α1 and α2 helices are omitted in this figure.

圖4 驅(qū)動蛋白力學(xué)傳遞的“蹺蹺板”模型驅(qū)動蛋白中心β片用藍色表示。Switch-Ⅰ和switch-Ⅱ組成了ATP結(jié)合腔,用黃色表示。α4螺旋用紅色表示。圖中頸鏈 (棕色)處于頸鏈結(jié)合腔。中心β片上的Tyr84和Phe82(藍色CPK模式)以及α4上的Leu258和Leu261(紅色CPK模式)組成了“蹺蹺板”的支點。黑色虛線是“蹺蹺板”板面示意圖。Fig.4 “Seesaw”model of kinesin’s mechanical force transmissionThe central β-sheet of kinesin is colored in blue.Switch-Ⅰand switch-Ⅱof the ATP-binding pocket are colored in yellow and α4 helix is colored in red.The neck linker(brown)in this figure is in the neck-linker-docking pocket.Tyr84 and Phe82(shown in blue CPK mode)of central β-sheet together with Leu258 and Leu261(shown in red CPK mode)of α4 form the pivot of“seesaw”.The black dotted line represents the board of the “seesaw”.

3 馬達結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)動與頸鏈對接的關(guān)系

對于頸鏈向馬達結(jié)構(gòu)域?qū)拥膯訖C制和對接過程,我們在綜述文獻[39]中進行了詳細的討論,此處不再贅述。值得注意的是,我們提出頸鏈在對接的初態(tài)構(gòu)象中與β0保持了4個氫鍵相互作用。此相互作用是驅(qū)動蛋白馬達結(jié)構(gòu)域中心β片轉(zhuǎn)動效果傳遞到頸鏈并啟動頸鏈對接的關(guān)鍵。頸鏈的N端連接的是α6螺旋。中心β片的彎曲和轉(zhuǎn)動效果無法直接影響α6螺旋和頸鏈。而β0直接與中心β片的β1相連,中心β片的轉(zhuǎn)動直接帶動β0的位移。此位移通過β0和頸鏈之間的4個骨架氫鍵傳遞到頸鏈,從而啟動頸鏈向馬達結(jié)構(gòu)域的對接。我們的全原子和粗?；肿觿恿W(xué)模擬結(jié)果也對此進行了證明[38,40～42]。

4 總結(jié)與展望

通過上述分析可知,驅(qū)動蛋白以兩種方式利用ATP的能量。首先,驅(qū)動蛋白的ATP結(jié)合位點與高度帶負電荷的ATP分子以及和ATP分子螯合的Mg2+發(fā)生特異性的結(jié)合,使得總能量降低,

由此產(chǎn)生的力使馬達結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點產(chǎn)生一系列構(gòu)象變化[9]。這些構(gòu)象變化經(jīng)過馬達結(jié)構(gòu)域其他元件的傳遞和放大,進而啟動驅(qū)動蛋白的力產(chǎn)生過程。此后,驅(qū)動蛋白會催化ATP分子發(fā)生水解反應(yīng)[23]。ATP水解反應(yīng)是一個放能過程,

所釋放的能量使得水解產(chǎn)物磷酸基團具有較高的能量,從而逃離驅(qū)動蛋白ATP結(jié)合位點周圍氨基酸殘基的束縛。在磷酸基團的釋放過程中,會誘導(dǎo)ATP結(jié)合位點產(chǎn)生一系列的構(gòu)象變化。這些構(gòu)象變化減弱了馬達結(jié)構(gòu)域與微管的相互作用。當(dāng)此頭部與其下一個微管結(jié)合位點結(jié)合時,ADP分子釋放,使驅(qū)動蛋白恢復(fù)到ATP結(jié)合之前的構(gòu)象,從而使驅(qū)動蛋白的下一個循環(huán)得以進行[27～28]。分子馬達研究的核心問題是其能量的利用和轉(zhuǎn)化的機制問題。此問題的解決是我們徹底理解分子馬達的標(biāo)志。通過相關(guān)學(xué)者30多年的努力,

對于驅(qū)動蛋白能量轉(zhuǎn)化問題的研究有了非常大的進展和突破。但是,我們還不能完全從氨基酸水平將整個過程描述清楚,需要進行更深入的研究工作。另外,由于核苷酸酶在核苷酸結(jié)合位點具有高度保守性,因此驅(qū)動蛋白能量轉(zhuǎn)化機制問題的研究對于其他核苷酸酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解也有非常大的指導(dǎo)意義。