趙 陽，鄭景輝，徐文華，趙新望，伍燕宏，羅 蔚，朱梓銘

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530001）

冠心病又稱為缺血性心臟病，屬于中醫(yī)的“胸痹”范疇，是最常見的心血管疾病。根據(jù)《中國心血管病報告2017》概要[1]，推算出我國冠心病患者約1 100 萬，居各類心臟病之首；另根據(jù)《2016 年中國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒》[1]，2015 年我國城市居民冠心病死亡率為0.11067%，農(nóng)村居民冠心病死亡率為0.11091%，較上一年（0.10750%、0.10537%）均有上升。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于冠心病的治療，主要有普通藥物治療、介入治療、外科手術(shù)治療三種方法[2]，但存在一些問題，如藥物的耐受性及藥物副反應(yīng)、介入治療后的冠脈再狹窄等。隨著我國冠心病的發(fā)病率和死亡率的逐漸上升，以及疾病治療模式的轉(zhuǎn)變，越來越多的人使用傳統(tǒng)中藥作為補充與替代療法。枳實薤白桂枝湯出自于東漢著名醫(yī)家張仲景的《金匱要略》，有通陽宣痹、瀉滿降逆的功效，主治胸陽不振、停痰蓄飲上逆、結(jié)滯胸中所致胸痛、胸部脹滿、心胸或胃脘部痞塞不通感等癥狀?，F(xiàn)代研究表明，枳實薤白桂枝湯具有抗炎、改善循環(huán)、抗血小板聚集、抗凝血、降脂、增加耐缺氧能力、保護缺血心肌等作用，尤其是桂枝揮發(fā)油對冠狀動脈免疫損傷性炎癥有顯著的拮抗作用[3]。但是當(dāng)前對枳實薤白桂枝湯治療冠心病的多成分、多靶點、多通路的作用機制研究尚不系統(tǒng)和全面，故本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在分子的水平上，從化學(xué)成分、靶點和信號傳導(dǎo)通路對枳實薤白桂枝湯治療冠心病的作用機制進行系統(tǒng)研究，為進一步揭示枳實薤白桂枝湯的藥理作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 枳實薤白桂枝湯化合物的收集與篩選

枳實薤白桂枝湯由瓜蔞、薤白、枳實、厚樸、桂枝5味藥組成。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）收集這5味中藥的化合物，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為限定條件篩選出有效化合物。

1.2 枳實薤白桂枝湯作用靶點的預(yù)測

將1.1中枳實薤白桂枝湯有效化合物以mol2格式上 傳 到 PharmMapper(http://lilab. ecust. edu. cn/pharmmapper/index.php)服務(wù)器平臺，選擇人類蛋白靶點作為藥效團映射，并設(shè)定返回靶點數(shù)為300 進行作用靶點預(yù)測。并將預(yù)測出的靶點導(dǎo)入STRING10.5 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）校正為其官方名稱并摘錄其標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 冠心病相關(guān)靶點的檢索

將“Coronary Artery Disease”作 為 檢 索 詞 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）檢索冠心病發(fā)病相關(guān)靶點。GeneCards 數(shù)據(jù)庫通過Gifts 算法，能夠計算靶點與疾病的相關(guān)度，選擇相關(guān)度得分≥30 的靶點進行研究，并摘錄相應(yīng)的靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.4 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的預(yù)測

將1.2 預(yù)測的枳實薤白桂枝湯作用靶點與1.3 檢索的冠心病相關(guān)發(fā)病靶點導(dǎo)入VENNY2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），得到兩組靶點的共同靶點，即枳實薤白桂枝湯作用于冠心病的靶點。并且將每個靶點與每個對其有藥理作用的化合物相對應(yīng)，用Cytoscape3.6.1軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析并做出化合物-靶點圖。

1.5 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了獲得枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點之間的聯(lián)系，將1.4 預(yù)測的枳實薤白桂枝湯作用冠心病的靶點上傳至STRING10.5 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），選擇研究物種為人類，設(shè)置靶點之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點聯(lián)系的靶點，獲得靶點聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)圖。將該圖進一步導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的富集分析和KEGG通路注釋分析

把枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點導(dǎo)入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 數(shù) 據(jù) 庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），分別選擇生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞成分（cellular component）對枳實薤白桂枝湯作用于冠心病的靶點進行GO 富集分析，選擇KEGG 進行靶點基因通路注釋分析。并且使用GraphPad Prism 7 軟件將GO 富集分析滿足PValue ＜0.05 的結(jié)果做成可視化條形圖；使用Omicshare (http://www.omicshare.com/)將得到的KEGG 靶點基因通路注釋分析滿足PValue ＜0.05的結(jié)果制作成可視化氣泡圖。

1.7 枳實薤白桂枝湯主要有效化合物與其作用的冠心病靶點分子對接

利用RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）查找枳實薤白桂枝湯作用的冠心病靶點的PDB ID，將mol2 格式的化合物與PDB ID 形式的靶點上傳至Systems Dock Web Site 數(shù)據(jù)庫（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）進行分子對接，通過所得的Docking Score 值分析對接分子與靶點之間的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 枳實薤白桂枝湯有效化合物收集結(jié)果

根據(jù)1.1 中限定的收集與篩選條件，共得到51 個化合物，分別是瓜蔞11個、薤白11個、枳實22個、厚樸2 個、桂枝7 個，其中beta-sitosterol 為桂枝和薤白共同含有，naringenin為枳實和薤白共同含有。各個中藥所含的有效化合物見表1。

2.2 枳實薤白桂枝湯作用靶點的預(yù)測

根據(jù)1.2 中設(shè)置的預(yù)測條件，PharmMapper Server平臺共預(yù)測出14 733 個枳實薤白桂枝湯作用靶點，刪除重復(fù)靶點后，剩余443 個靶點，將這些靶點導(dǎo)入STRING10.5 數(shù)據(jù)庫校正后，獲得381 個靶點及對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

2.3 冠心病發(fā)病靶點檢索

根據(jù)1.3 中設(shè)置的檢索條件，GeneCards 數(shù)據(jù)庫共檢索出5 264 個與冠心病發(fā)病相關(guān)的靶點，相關(guān)度最高的靶點是Apolipoprotein E（114.83 分），相關(guān)度最低的靶點是Blood Pressure QTL 類靶點（0.19 分）。相關(guān)度得分≥30的靶點共219個。

表1 枳實薤白桂枝湯有效化合物表

2.4 枳實薤白桂枝湯作用冠心病靶點的預(yù)測

將2.2、2.3 結(jié)果中靶點的基因名導(dǎo)入VENNY2.1軟件，共得到了31 個共同靶點，即枳實薤白桂枝湯作用于冠心病的靶點，具體流程見圖1。將每個化合物與其作用的靶點相聯(lián)系，共得到1 186 對相關(guān)的聯(lián)系，通過Cytoscape3.6.1 軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析得出作用靶點數(shù)排名前8 的化合物依次是：(+)-catechin（27 個）、Prangenin（27 個）、coumaroyltyramine（26 個）、Eriodyctiol（26 個）、taxifolin（26 個）、Vitamin-e（26 個）、poncimarin（26 個）、Hesperetin（26 個），做出化合物-靶點聯(lián)系圖見圖2。

2.5 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)1.5 中對靶點之間最低要求聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4的設(shè)定，STRING10.5 數(shù)據(jù)庫獲得31 個靶點之間共166條聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。將圖導(dǎo)入Cytoscape3.6.1 軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析得出聯(lián)系其他靶點個數(shù)排名前10 的靶點依次是：ALB（27 個）、ACE（21 個）、REN（19 個）、F2（18個）、NOS3（18 個）、MAPK1（18 個）、MMP9（18 個）、MMP2（15 個）、PPARG（15 個）、SELE（15 個），而有3 組靶點之間的聯(lián)系程度較高，第一組包括的靶點F2、F10、F7、GP1BA、ALB、PLAT，第二組包含的靶點有REN、ACE、NOS3、ESR1、MAPK1、JAK2、NOS2，第三組包含的靶點有MMP1、MMP2、MMP3、MMP9。構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

圖1 枳實薤白桂枝湯作用冠心病靶點的預(yù)測圖

圖2 枳實薤白桂枝湯有效化合物作用冠心病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的GO富集分析和KEGG通路注釋分析

根據(jù)1.6 中的分析方法，GO 富集分析在生物過程、分子功能、細胞成分三個方面，分別得到76 個條目、26 個條目、14 個條目。生物過程排名前十的條目中，與冠心病相關(guān)的包括：response to estrogen、blood coagulation、leukocyte migration、angiotensin maturation；分子功能排名前十的條目中，與冠心病相關(guān)的包括：zinc-ion binding、heme binding；細胞成分排名前十的條目中，與冠心病相關(guān)的包括：caveola、proteinaceous extracellular matrix，三個方面各選取前10 條條目做成可視化條形圖，見圖4；KEGG 通路注釋分析得到19 條通路，與冠心病相關(guān)的包括：Estrogen signaling pathway、PPAR signaling pathway、Complement and coagulation cascades、Renin-angiotensin system、TNF signaling pathway、TGF-beta signaling pathway，可視化氣泡圖見圖5。

圖3 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 枳實薤白桂枝湯主要有效化合物與其作用的冠心病靶點分子對接結(jié)果

圖4 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的GO富集分析

根據(jù)2.4 中枳實薤白桂枝湯有效化合物拓?fù)鋵W(xué)分析 的 排 名 結(jié) 果，選 取(+)-catechin（MOL000492）、Prangenin （MOL013430） 、 coumaroyltyramine（MOL000631）、Eriodyctiol(flavanone)（MOL002914）、taxifolin（MOL004576）這5 個排名前五的化合物作為主要有效化合物與枳實薤白桂枝湯作用的31 個冠心病靶點進行分子對接。一般認(rèn)為Docking Score 值＞4.25 表示對接分子與靶點之間有一定的結(jié)合活性，＞5.0 表明對接分子與靶點之間有較好的結(jié)合活性，＞7.0 則說明具有強烈的結(jié)合活性。本研究的155 組對接中，Docking Score 值＞8 的有1 組，Docking Score值＞7 的有5 組，Docking Score 值＞6 的 有74 組，Docking Score 值＞5 的有91 組，Docking Score 值＞4.5的有102組，各組分子對接詳情見表2和圖6。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種結(jié)合系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析和藥理學(xué)的方法，可以在分子水平上對藥物治療疾病的有效成分、靶點、通路進行系統(tǒng)研究，從而了解成分、靶點、通路之間的相互作用關(guān)系。由于中藥方劑具有多成分、多靶點、多通路的特征，僅研究單一的成分、靶點或者通路難以全面地了解中藥治療的作用機制，所以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法為中藥研究提供了新的思路和方法。

表2 枳實薤白桂枝湯主要有效化合物與其作用的冠心病靶點分子對接結(jié)果

研究結(jié)果顯示，枳實薤白桂枝湯的51個有效化合物，與其作用的31 個冠心病靶點之間共有1 186 對藥理作用，平均每個化合物作用23 個靶點，平均每個靶點能被38個化合物作用，表明在枳實薤白桂枝湯作用于冠心病靶點的過程中，同一個化合物可作用于多個靶點，同一個靶點也可以被多個化合物作用，不同的藥物之間，不同的化合物之間，存在著共同作用或協(xié)同作用。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，作用靶點數(shù)排名前8 的化合物中，(+)-catechin（兒茶素）能夠抑制血管平滑肌細胞的黏附和遷移，抑制血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑肌細胞的生長和繁殖[4-5]；coumaroyltyramine（香豆?；野罚┠軌蛞种埔阴Ｄ憠A酯酶、細胞增殖、血小板聚集以及抗氧化[6]；taxifolin（紫杉葉素）具有降低餐后血糖的作用，還有抗炎與抗氧化的功能[7]；Vitamin-e（維生素E）被證明可減少糖尿病患者心血管事件的發(fā)生，從而降低死亡率[8]；poncimarin（香豆素衍生物）能夠通過抑制膽固醇合成的靶點減低血膽固醇，從而降低動脈粥樣硬化和冠心病的危險因素[9]；Hesperetin（橙皮素）具有良好的抗血小板聚集和抗凝血作用，對心肌缺血和梗塞治療效果良好[10]。

圖5 枳實薤白桂枝湯對冠心病作用靶點的KEGG通路注釋分析

圖6 枳實薤白桂枝湯主要有效化合物與其作用的冠心病靶點分子對接結(jié)果

在枳實薤白桂枝湯作用冠心病的31個靶點中，有3 組靶點之間的聯(lián)系程度較高。第一組靶點是F2、F10、F7、GP1BA、ALB、PLAT，其中F2、F10、F7 均屬于凝血因子，是冠心病血液凝固堵塞冠脈過程中必不可少的過程；GP1BA 是血小板膜上血管性血友病因子（vWF）受體組成的必須成分，只有通過vWF 與血小板膜上vWF 受體結(jié)合，血小板才能黏附在血管壁上起到凝血的作用[11]；ALB 是血清白蛋白，研究表明，正常濃度的血清白蛋白可以抑制血小板的活化和聚集，從而減少冠心病的發(fā)病危險[12]；PLAT是組織型纖溶酶原激活物，在血液中起著抗凝的作用。第二組靶點是REN、ACE、NOS3、ESR1、MAPK1、JAK2、NOS2，REN（腎素）與ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）是RAAS系統(tǒng)的重要組成，是生成血管緊張素Ⅱ的必要條件，血管緊張素Ⅱ能促進醛固酮釋放，使血管增生、動脈粥樣硬化，心臟重構(gòu)[13]；NOS3與NOS2均為一氧化氮合酶，生成體內(nèi)的NO，而適當(dāng)濃度的NO 夠抑制血管平滑肌細胞增生、擴張血管、抗低密度脂蛋白氧化、抗血小板聚集、抗白細胞黏附、拮抗血管緊張素Ⅱ[14]；ESR1 為雌激素受體Ⅰ，而雌激素有抗動脈粥樣硬化的作用；MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）與JAK2（Janus 酪氨酸激酶2）是生物體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，在冠脈內(nèi)皮細胞的炎癥性反應(yīng)、增殖、分化、凋亡等過程中有重要調(diào)控作用[15]。第三組靶點是MMP1、MMP2、MMP3、MMP9，這4個靶點均為基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP），研究表明，細胞外基質(zhì)是粥樣斑塊穩(wěn)定的重要因素，而MMP能夠降解細胞外所有的基質(zhì)成分，其中MMP2 與MMP9 對冠脈粥樣硬化斑塊破裂的影響尤為嚴(yán)重[16-17]。分析這3組靶點可以發(fā)現(xiàn)，第一組靶點主要與冠心病的凝血機制有關(guān)，第二組靶點主要與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制、NO 保護、雌激素保護機制有關(guān)，第三組靶點主要與冠脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定機制有關(guān)。這3組聯(lián)系程度較高的17 個靶點，包含了8 個與其他靶點聯(lián)系個數(shù)排名前十的靶點，故分析這3 組靶點能較好地體現(xiàn)出枳實薤白桂枝湯治療冠心病的作用機制。

對枳實薤白桂枝湯作用冠心病的31 個靶點進行GO 富集分析，生物過程方面，排名前十的條目中，除了response to estrogen（雌激素反應(yīng)）、blood coagulation（凝血）、angiotensin maturation（血管緊張素成熟）與冠心病關(guān)系較密切之外，leukocyte migration（白細胞遷移）過程使白細胞進入內(nèi)膜下與血管內(nèi)皮細胞黏附，從而引起內(nèi)膜損傷并繼發(fā)炎癥引起冠脈粥樣硬化[18]。分子功能方面，排名前十的條目中，zinc ion binding（鋅離子結(jié)合）功能能使鋅離子發(fā)揮抗氧化作用，及時清除氧自由基，保護血管內(nèi)皮不受損傷[19]；heme binding（血紅素結(jié)合）功能使血液中多余的游離血紅素與血紅素結(jié)合蛋白相結(jié)合后清除，防止游離血紅素導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)對心血管系統(tǒng)造成損傷并加重炎癥反應(yīng)[20-21]。細胞成分方面，排名前十的條目中，caveola（小窩；小凹）位于細胞膜上，是小凹蛋白-1 表達的場所，而小凹蛋白-1 能表達于炎癥細胞，對炎癥反應(yīng)起負(fù)調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)，小凹蛋白-1 的低表達與冠脈粥樣斑塊的形成與不穩(wěn)定密切相關(guān)[22]；proteinaceous extracellular matrix（蛋白質(zhì)性細胞外基質(zhì)）則與粥樣斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。通過GO 富集分析，進一步得出枳實薤白桂枝湯治療冠心病可能與雌激素反應(yīng)、抗凝、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定粥樣斑塊這6個機制有關(guān)。

圖7 TNF signaling pathway流程圖

6 條KEGG 分析所得的與冠心病關(guān)系密切的6 條通路中，除Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）、Complement and coagulation cascades（補體和凝血級聯(lián)）、Renin-angiotensin system（腎素血管緊張素系統(tǒng)）分別與冠心病雌激素反應(yīng)、凝血、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制關(guān)系密切之外，PPAR signaling pathway（過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路）中，過氧化物酶體增殖物激活受體通過促進脂肪細胞合成、抑制脂肪細胞分解來調(diào)節(jié)血脂，從而預(yù)防冠脈粥樣硬化及血管炎癥反應(yīng)[23-24]；TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號通路）中，腫瘤壞死因子可以誘導(dǎo)白細胞介素等促炎細胞因子，從而引起炎癥反及損傷血管內(nèi)皮細胞[25]；TGF-beta signaling pathway（轉(zhuǎn)化生長因子信號通路）中，轉(zhuǎn)化生長因子能夠抑制TNF-α、IL-1、IL-2 等細胞因子的表達及其作用，從而抑制冠脈炎癥反應(yīng)，且能增加細胞外基質(zhì)并抑制基質(zhì)金屬酶作用，從而達到穩(wěn)定斑塊的作用[26]。本研究選取TNF signaling pathway闡述其通路機制，見圖7，細胞外的TNF 與細胞膜上的受體TNFR1 結(jié)合后，信號傳遞到細胞內(nèi)，激活MAPK信號通路，MAPK 信號通路是由MAP3K-MAP2KMAPK 三級激酶組成的級聯(lián)反應(yīng)，TNF 與膜上受體結(jié)合產(chǎn)生的信號依次激活MAP3K、MAP2K、MAPK，最后將信號傳達至下游應(yīng)答分子，從而調(diào)控細胞的分化、增殖、凋亡等生理過程[27-28]。圖7中細胞內(nèi)紅色五角心表示ERK1/2，是MAPK 信號通路的一種，可以磷酸化一系列蛋白，包括代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白等，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄與表達以達到調(diào)控細胞的作用[29]。如圖7 所示，本條研究的通路中，細胞外的TNF 刺激信號通過ERK1/2 傳遞至細胞核，經(jīng)過細胞核的轉(zhuǎn)錄與表達，引起MMP3、MMP9、SELE 等成分表達的變化。研究表明，MMP3 與MMP9 能夠降解細胞外的基質(zhì)成分，破壞冠脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性；SELE（選擇素E）是由血管內(nèi)皮細胞胞外部分的酶裂解而來，并在血液中循環(huán)，血液中的SELE 能介導(dǎo)白細胞滲出，在血管內(nèi)皮細胞表面聚集和黏附多種白細胞和T 細胞及其亞型，促發(fā)冠脈炎癥反應(yīng)，是動脈粥樣硬化形成的重要機制[30]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究枳實薤白桂枝湯治療冠心病的作用機制，通過對枳實薤白桂枝湯作用冠心病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析、GO分析、KEGG通路分析，預(yù)測出枳實薤白桂枝湯可能通過抗凝血、穩(wěn)斑塊、抗氧化、抗炎癥、降血脂、抑制RASS系統(tǒng)、增加NO保護、促進雌激素保護這些機制起到治療冠心病的作用。并且通過分子對接方法，驗證了枳實薤白桂枝湯有效化合物對冠心病相關(guān)靶點有較好的結(jié)合活性，證明了本研究預(yù)測的真實性。下一步，本課題組將通過臨床試驗進一步驗證枳實薤白桂枝湯對冠心病各個靶點、各條通路的作用，以期全面闡釋其作用機制。