孔祥如，修蕓

1.重慶醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院腫瘤外科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,重慶 400014

認(rèn)知障礙（缺陷）是精神分裂癥的核心癥狀之一，但目前抗精神病藥物對(duì)改善認(rèn)知障礙癥狀大都效果不佳。建立穩(wěn)定可靠的具有預(yù)測(cè)效應(yīng)的精神分裂癥認(rèn)知障礙動(dòng)物模型[1]將為精神分裂癥的研究創(chuàng)造條件。研究表明NMDA受體拮抗劑可誘發(fā)出精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀和認(rèn)知能力下降的癥狀[2-3]。該研究于2016年9月—2017年9月在重慶國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心采用C57BL/6J小鼠長(zhǎng)期腹腔注射N(xiāo)MDA受體拮抗劑MK-801制備精神分裂癥認(rèn)知障礙小鼠模型，通過(guò)Morris水迷宮測(cè)試的相關(guān)指標(biāo)，探討谷氨酸功能低下小鼠模型在精神分裂癥認(rèn)知障礙方面的的行為學(xué)改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物來(lái)源：重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，周齡為8周齡，雄性小鼠48只，隨機(jī)分為MK-801慢性給藥模型組及對(duì)照組，每組12只；小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：21～22℃的恒溫房間且每隔12 h調(diào)節(jié)光暗。

1.2 藥物及給藥方法

(+)-MK-801 hydrogen maleate購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（產(chǎn)品編號(hào)：M107），用生理鹽水稀釋成濃度為5 mg/mL液體，然后每日根據(jù)腹腔注射的濃度進(jìn)行配比。Ⅰ組濃度為 0.25 mg/mL、II組濃度為 0.5 mg/mL、III組濃度為 0.01 mg/mL，進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。藥物注射持續(xù)14 d，前8 d藥物注射時(shí)間為每日上午10：00-11：00，第9～14天藥物注射時(shí)間為每日下午1：00-2：00

1.3 水迷宮測(cè)試步驟

水迷宮測(cè)試時(shí)間為第9～15天（每日上午8:30-12:00）。該次實(shí)驗(yàn)分為兩部分：隱匿平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)：將小鼠置于水迷宮的房間適應(yīng)半小時(shí)，每只小鼠每天均訓(xùn)練4次，面向池壁將小鼠從東、南、西、北4個(gè)方向放入水中，記錄小鼠的逃避潛伏期；在60 s內(nèi)還未找到平臺(tái)，將小鼠引至平臺(tái)，并記錄逃避潛伏期為60 s。最后都讓小鼠在平臺(tái)停留15 s，根據(jù)東、南、西、北4個(gè)方向的參照物進(jìn)行學(xué)習(xí)、記憶?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練第7天將平臺(tái)撤出，選擇入水點(diǎn)2個(gè)，把小鼠放入水中60 s，測(cè)量：目標(biāo)象限滯留時(shí)間、游泳路程及速度。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件一般線(xiàn)性模型(general linear model,GLM)的repeated measures和multivariate過(guò)程對(duì)定位航行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析和多元方差分析,并進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn) （Bonferroni法）和不同組間（LSD）的兩兩比較?？臻g探索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隱匿平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)（定位航行實(shí)驗(yàn)）

經(jīng)過(guò)6 d尋找隱藏平臺(tái)的訓(xùn)練，各組動(dòng)物的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加迅速下降 (圖1-A)：球形檢驗(yàn)(Mauchly’s Test of Sphericity)的結(jié)果表明訓(xùn)練6 d期間重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)之間存在高度相關(guān)性 （F=127.361，P＜0.001），但時(shí)間（訓(xùn)練天數(shù)）和分組的交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.146，P=0.337)。MK-801處理因素分析顯示，各組間動(dòng)物的逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=0.761，P=0.522）。但組間兩兩比較顯示，訓(xùn)練第3天，1 mg/kg MK-801劑量組小鼠逃避潛伏期顯著高于對(duì)照組小鼠（圖1-B）。對(duì)照組及0.5 mg/kg MK-801劑量組分別于訓(xùn)練第3天和第2天出現(xiàn)逃避潛伏期的顯著性減少并維持在此水平 （提示學(xué)習(xí)能力的顯著性提升），但0.25 mg/kg和1 mg/kg MK-801劑量組則均在第4天逃避潛伏期才較前1 d顯著性降低（見(jiàn)表1）。

2.2 撤平臺(tái)實(shí)驗(yàn)（空間探索實(shí)驗(yàn)）

各組動(dòng)物間穿越平臺(tái)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.882），各組動(dòng)物在目標(biāo)象限停留時(shí)間最多，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.864），各組間動(dòng)物的游泳速度 （P=0.478）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖 1-C、D、E）。

圖1 不同劑量MK-801組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（實(shí)驗(yàn)一，均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤）A-B、（空間記憶采集）隱匿平臺(tái)逃避潛伏期；C-E、(空間探索實(shí)驗(yàn)）C-目標(biāo)象限停留時(shí)間；D-穿臺(tái)次數(shù)；E-平均泳速。

表1 各組小鼠不同訓(xùn)練天數(shù)逃避潛伏期的差別[（±s），s]

表1 各組小鼠不同訓(xùn)練天數(shù)逃避潛伏期的差別[（±s），s]

注：* 較前 1 d 比較，P＜0．05；#較訓(xùn)練第 1 天比較，P＜0．05；△較對(duì)照組比較，P＜0．05。

訓(xùn)練天數(shù)對(duì)照組（n=12）0．25 mg／kg 組（n=12）0．5 mg／kg 組（n=12）1 mg／kg 組（n=12）第1天第2天第3天第4天第5天第6天42.24±11.06 26.97±15.60（11.34±5.85）*#（10.49±3.88）#（9.31±3.05）#（7.73±3.79）#47.06±12.90 33.28±19.55（21.72±14．50）#（12.93±11.10）*#（8.32±3.43）#（7.44±3.02）#43.88±11.36（24.59±14.41）*#（12.34±5.48）#（11.58±5.69）#（6.56±2.48）#（6.43±1.93）#40.47±12.03 28.87±16.63（21.60±18.42）*△（14.08±14.48）*#（11.26±13.33）#（9.06±8．04）#

表2 對(duì)照組和1 mg/kg組小鼠不同訓(xùn)練天數(shù)逃避潛伏期的差別（±s）

表2 對(duì)照組和1 mg/kg組小鼠不同訓(xùn)練天數(shù)逃避潛伏期的差別（±s）

注：* 較前 1 d 比較，P＜0．05；# 較訓(xùn)練第 1 天比較，P＜0．05；△較對(duì)照組比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組(n=12）1mg／kg組(n=12）逃避潛伏期第1天 第2天 第3天 第4天27.86±12.08（40.23±9.20）△20.11±10.95（26.20±14.46）*#22.47±14.01（24.94±14.10）#19.18±12.38（21.04±12.38）#

圖2 MK-801及對(duì)照組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（實(shí)驗(yàn)二，均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）A、（空間記憶采集）隱匿平臺(tái)逃避潛伏期；B、(空間探索實(shí)驗(yàn)）從左至右分別為目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)和平均泳速。

3 討論

精神分裂癥患者常表現(xiàn)出典型的妄想、幻覺(jué)及社交退縮、情感淡漠、意志減退或認(rèn)知障礙。由于病因及癥狀的復(fù)雜性，加之妄想、幻覺(jué)等癥狀在動(dòng)物身上很難模擬和量化[4]。NMDA受體拮抗劑制備的精神分裂癥動(dòng)物模型因能誘發(fā)出更全面的精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀和認(rèn)知能力下降的癥狀,同時(shí)能復(fù)制精神分裂癥的誘發(fā)因素并對(duì)已知有效的治療方法做出評(píng)估，正被廣泛的應(yīng)用于精神分裂癥病因機(jī)制的研究中[5]。Morris水迷宮是由英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的，目前Morris水迷宮已成為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平的重要工具實(shí)驗(yàn)之一。該研究中，我們采用NMDA受體拮抗劑MK-801連續(xù)2周腹腔注射的方法來(lái)制備精神分裂癥小鼠模型。實(shí)驗(yàn)采用了0.25 mg/kg,0.5 mg/kg和1 mg/kg 3個(gè)劑量，結(jié)果顯示，MK-801各劑量組小鼠在注射急性期（注射30 min內(nèi)）均有自發(fā)性活動(dòng)增加，1 mg/kg劑量組小鼠還出現(xiàn)后肢功能障礙和共濟(jì)失調(diào)的現(xiàn)象（錄像示），該現(xiàn)象1 h后消失，這與王瀚等[6]的研究結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠相比逃避潛伏期延長(zhǎng)分別為 (61.5±6.3)s、(37.6±6.0)s。 此外，MK-801 注射第 9 天，MK-801組小鼠可見(jiàn)平臺(tái)逃避潛伏期時(shí)間顯著高于對(duì)照組小鼠，這與胡志紅等[7]的研究結(jié)果一致，注射一周左右，平臺(tái)逃避潛伏期時(shí)間對(duì)照組為（20.13±11.49）s,實(shí)驗(yàn)組為（37.73±43.15)s,提示精神分裂癥小鼠模型制備的成功。但定位航行：各組小鼠逃避潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而下降，訓(xùn)練第4天4組小鼠逃避潛伏期分別為 （42.24±11.06）s、（47.06±12．90）s、（43.88±11.36）s、（40.47±12.03）s，而第六天下降為 （7.73±3.79）s、（7.44±3.02）s、（6.43±1.93）s、（9.06±8．04）s， 但各組間動(dòng)物的逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.761，P=0.522）；兩兩比較：訓(xùn)練第 3 天，1 mg/kg MK-801劑量組小鼠逃避潛伏期 （21.60±18.42）s顯著高于對(duì)照組小鼠（11.34±5.85）s（F=127.361，P＜ 0.001）；空間探索：各組小鼠間穿臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間、平均游泳速度及游泳總路程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，該研究提示Morris水迷宮傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不易評(píng)估MK-801（NMDA受體阻斷）誘導(dǎo)的谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的認(rèn)知障礙。如研究者們擬采用Morris水迷宮對(duì)此類(lèi)小鼠模型進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力 （或認(rèn)知能力）的評(píng)估，應(yīng)設(shè)計(jì)或采用更為敏感的方案及指標(biāo)。