宋穎超，白麗娟，任曉晗，楊翠香，張自富，陳思睿*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；2.高郵市廣游生態(tài)養(yǎng)禽場，江蘇高郵 225600；3.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽 464000）

在黃羽肉雞養(yǎng)殖中，飼料成本占養(yǎng)殖成本的60%～70%[1-2]，因此，提高飼料利用效率是降低養(yǎng)殖成本、提高收益的主要手段之一。國際上，飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Ratio，F(xiàn)CR）[1]和剩余采食量（Residual-Feed Intake，RFI）[1-3]是衡量飼料利用效率的2個(gè)有效指標(biāo)。本試驗(yàn)據(jù)此2種指標(biāo)，組建快大型黃羽肉雞高、低飼料效率組。近年來，隨著宏基因組學(xué)和宏基因組技術(shù)的發(fā)展，微生物在宿主飼料效率方面的重要性逐漸被揭示。有研究表明，擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門之間的互作關(guān)系可幫助宿主消化難以分解的多糖類物質(zhì)[4]，從而提高機(jī)體對于糖類物質(zhì)的消化和吸收。Turnbaugh等[5]指出，腸道微生物通過將難以消化的多糖發(fā)酵為單糖及短鏈脂肪酸從而調(diào)控脂肪沉積。Fetissov[6]指出，腸道微生物與宿主的饑餓和飽腹感有關(guān)，腸道微生物調(diào)節(jié)宿主攝食從而維持機(jī)體正常生長、發(fā)育的營養(yǎng)代謝。目前，國內(nèi)外畜牧領(lǐng)域關(guān)于腸道微生物與宿主飼料效率的關(guān)系在豬[7]、牛[8]、雞[9]等農(nóng)業(yè)動(dòng)物中均有報(bào)道，但腸道微生物與快大型黃羽肉雞之間的互作關(guān)系未見報(bào)道。盡管糞便微生物不能代表整個(gè)宿主消化道內(nèi)菌群豐度及分布概況，且個(gè)體間差異較大，但糞便微生物的一些變化規(guī)律仍可與宿主生理狀態(tài)及健康狀況有一定聯(lián)系[4]，臨床上糞便微生物被廣泛用做機(jī)體健康狀況的診斷依據(jù)。因此，本研究提取快大型黃羽肉雞的糞便微生物DNA做分析，探究其與宿主飼料效率之間的互作關(guān)系，挖掘影響黃羽肉雞飼料效率的作用菌群。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及方法 試驗(yàn)群體選自江蘇興牧農(nóng)業(yè)有限公司270只1日齡快大型黃羽肉公雞。試驗(yàn)群體處于相同的飼養(yǎng)環(huán)境下，單籠飼喂，飼養(yǎng)至63日齡，每5 d稱量體重及耗料量，保證個(gè)體之間無接觸。剔除因死亡而數(shù)據(jù)記錄不全的個(gè)體后，利用剩余213只數(shù)據(jù)計(jì)算雞群RFI和FCR，綜合FCR和RFI分別選取高飼料效率組（High Feed Efficiency，HFE）和低飼料效率組（Low Feed Efficiency，LFE）各29只，采集其糞便樣本，用Omega試劑盒（廣州飛揚(yáng)生物技術(shù)有限公司）提取糞便微生物DNA，保存于-20℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 個(gè)體選擇指標(biāo)

其中，F(xiàn)I為5～63日齡采食量，BWG為5～63日齡體增重。

其中，F(xiàn)I為5～63日齡采食量，MBW為5～63日齡平均代謝體重，ADG為5～63日齡平均日增重，b0、b1和b2是對應(yīng)的偏回歸。

1.3 16 S rDNA V4區(qū)高通量測序 試驗(yàn)采取IlluminaHiseq 2500 PE250高通量測序平臺(tái)，對糞便微生物DNA V4高變區(qū)進(jìn)行測序，引物設(shè)計(jì)采用通用引物，具體為515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR 反 應(yīng) 體 系50 μL：正向和反向引物各 10 μL(0.5 μmol/L)、2×Mster mix 25 μL、30 ng模板DNA。熱循環(huán)反應(yīng)：95℃初變性3 min，95℃變性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5 min。最后將目的區(qū)域DNA片段進(jìn)行建庫并在IlluminaHiseq 2500測序平臺(tái)上進(jìn)行文庫測序，產(chǎn)生約240 bp片段。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理后獲得Clean Tags，利用UPARSE在97%相似度下對Clean Tags進(jìn)行聚類，得OTU（Operational Taxonomic Units）的代表序列，利用UCHIME（v4.2.40）[10]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除[16S 嵌合體數(shù)據(jù)庫：gold database（v20110519）]， 使 用 usearch_global方法將所有Tags比對回OTU代表序列，得到OTU代表序列后，通過RDP classifer（v2.2）軟件將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫有比對進(jìn)行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.8。

1.5 OTU統(tǒng)計(jì)及微生物分析 OTU Venn圖、PCA（Principal-Component Analysis）主成分分析、NMDS （Non-metric-Multi-dimensional Scaling）、OTU Rank曲 線 均 用 R（v3.1.1）軟件作圖，用QIIME[11]軟件將OTU代表序列進(jìn)行比對，并根據(jù)比對序列，挑選每個(gè)屬豐度最高的序列作為代表序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用mothur（v1.31.2）軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，通過QIIME（v1.80）進(jìn)行Beta多樣性分析。利用Metastats軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)2組樣品間微生物群落豐度的差異，并用FDR（False Discovery Rate）評估差異的顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 個(gè)體表型及測序數(shù)據(jù) 高、低飼料效率組個(gè)體的選擇如圖1所示，F(xiàn)CR和RFI都可以作為高、低飼料效率組的分組依據(jù)，個(gè)體選擇結(jié)果是一致的。根據(jù)糞便微生物DNA 16S rDNA測序結(jié)果，本試驗(yàn)樣本Tags總數(shù)為4 083 573，平均70 409.53條，OTU總數(shù)為17 632，平均304個(gè)，高低飼料效率兩組黃羽肉雞糞便微生物共有760條OTU，低飼料效率特有OTU（71）高于高飼料效率（56）黃羽肉雞（圖2）。PCA主成分分析及NMDS非度量多維尺度分析如圖3、4所示，本試驗(yàn)群體在2個(gè)主要作用成分上無明顯差別，且表現(xiàn)較高相似性。

圖1 FCR和RFI雙選擇下個(gè)體分布

圖2 高、低飼料效率組Venn圖

圖3 主成分分析圖

圖4 非度量多維尺度分析

圖5 菌群相對豐度餅圖

2.2 豐度差異 高、低飼料效率組在門、綱、目、科、屬、種水平上，優(yōu)勢菌群的種類一致，但豐度有差異（圖5）。在門水平上，厚壁菌門（HFE：74.05%，LFE：68.48%）、變形菌門（HFE：18.66%，LFE：23.91%）和藍(lán)藻菌門（HFE：2.71%，LFE：2.43%）在高、低飼料效率組中豐度較高（P＞0.05）；柔壁菌門在高、低飼料效率組糞便微生物中差異顯著（P＜0.05），分別占比1.37%和0.23%。在綱水平上，豐度較高的芽孢桿菌綱（HFE：43.72%，LFE：48.24%）、梭菌綱（HFE：29.43%，LFE：19.84%）、γ變形菌綱（HFE：18.48%，LFE：23.73%）在高、低飼料效率組中差異均不顯著（P＞0.05）。在目水平上，相對豐度前三位的分別為乳桿菌目（HFE：34.93%，LFE：48.09%）、腸桿菌目（HFE：18.34%，LFE：23.67%）和梭菌目（HFE：29.42%，LFE：19.82%）， 且 3個(gè) 菌 目在2組水平上差異均不顯著。在科水平上，相對豐度排名前三的分別為乳桿菌科（HFE：35.48%，LFE：41.94%）、腸桿菌科（HFE：18.43，LFE：23.69%）和 瘤 胃 菌 科（HFE：11.22%，LFE：11.50%）， 且差異均不顯著。此外，梭菌科在豐度上排名第四，但是在高（7.84%）、低（1.81%）飼料效率組中差異極顯著（P＜0.01）。在屬水平上，乳酸菌屬（HFE：35.37%，LFE：41.89%）、艾希氏桿菌屬（HFE：18.03%，LFE：19.97%）、腸球菌屬（HFE：7.41%，LFE：5.66%）差異均不顯著。SMB53在屬水平糞便微生物豐度水平排名僅次于腸球菌屬，但其在高、低飼料效率組（HFE：7.14%，LFE：1.41%）糞便微生物豐度差異極顯著（P＜0.01）。種水平，高、低飼料效率組糞便微生物中排名前三的分別為大腸桿菌（HFE：17.97%，LFE：19.90%）、盲腸腸球菌（HFE：7.38%，LFE：5.62%）和柔嫩梭菌（HFE：4.53%，LFE：5.82%），且差異均不顯著。

2.3 微生物多樣性

2.3.1 個(gè)體微生物多樣性 個(gè)體微生物多樣性采用Alpha多樣性分析[11]來表示，具體用observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)表示物種豐富度和均勻度，前4項(xiàng)越高，最后1項(xiàng)越低，表示物種越豐富。高、低飼料效率組糞便微生物多樣性對比用表1表示，其圖形結(jié)果用圖6表示。本次試驗(yàn)中，組內(nèi)群體多樣性及豐富度均較高，但高、低飼料效率組間的所有指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 樣品間微生物多樣性 高、低飼料效率組黃羽肉雞糞便微生物用Beta多樣性表示，運(yùn)用QIIME（v1.80）平衡各樣本所得序列，根據(jù)計(jì)算平衡序列距離，得Bray-Curtis、weighted UniFrac、unweightedUniFrac 用以表示樣品間多樣性。如圖7～9示，本次試驗(yàn)58個(gè)個(gè)體糞便微生物樣品間多樣性并無明顯差別，且高低飼料效率2組糞便微生物親緣關(guān)系較近。

表1 Alpha組間多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖6 組間Alpha多樣性盒型圖

圖7 Bray-curtis熱圖

圖8 weighted unifrac熱圖

圖 9 unweightedunifrac熱圖

3 討 論

3.1 門水平差異菌群 微生物運(yùn)用其快捷的消化代謝機(jī)制參與宿主飼料轉(zhuǎn)化主要是機(jī)體的糖代謝過程，包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和厭氧分解途徑[13]。研究表明，厚壁菌門可分解葡聚糖[14-15]、肽聚糖[16]、糖原[17]等腸道內(nèi)宿主無法消化的多糖類物質(zhì)，將其分解為宿主可消化的小分子糖類，從而促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，進(jìn)而提高飼料效率。擬桿菌門和柔壁菌門在高、低飼料效率組中差異顯著，這3個(gè)糞便微生物中豐度相對較高的菌門在高飼料效率組中占比較高，這可能與該組個(gè)體較高飼料轉(zhuǎn)化率有關(guān)。Kaoutari等[18]構(gòu)建以厚壁菌門、擬桿菌門為主要豐度的微生物區(qū)系探究人體腸道微生物內(nèi)碳水化合物活性酶的分布和豐度，結(jié)果示厚壁菌門和擬桿菌門微生物基因主要編碼碳水化合物活性酶（CarboHydrate-active Enzymes，CAZyme），CAZyme主要分解碳水化合物，因此高飼料效率組中厚壁菌門、擬桿菌門以及柔壁菌門的豐度較高是造成其飼料轉(zhuǎn)化率高于低組的主要原因。同時(shí)，黃羽肉雞糞便微生物中厚壁菌門豐度最高，這與嚴(yán)偉[4]在矮小型褐殼蛋雞糞便微生物中得出厚壁菌門是優(yōu)勢菌門的結(jié)果一致。因此，在雞腸道微生物中，以厚壁菌門為優(yōu)勢菌門，厚壁菌門和擬桿菌門占主要豐度的微生物菌群組成是造成飼料效率高的主要原因之一，其中厚壁菌門和擬桿菌門在影響飼料效率方面起主要作用。

3.2 綱、目、科、屬水平差異菌群 在綱水平，豐度較高的芽孢桿菌綱、梭狀芽胞桿菌綱、擬桿菌綱及柔膜菌綱均屬于3個(gè)菌門（厚壁菌門、擬桿菌門、柔壁菌門），其中芽孢桿菌綱和梭狀芽胞桿菌綱屬于厚壁菌門，擬桿菌綱屬于擬桿菌門，柔膜菌綱屬于柔壁菌門。柔壁菌門細(xì)菌無細(xì)胞壁，作為其唯一分支的柔膜菌綱自身多數(shù)生物合成功能退化，需依靠宿主完成自身核酸、氨基酸及脂肪酸生物合成[19]，因此，柔膜菌綱在高、低飼料效率組的差異及功能水平可代表柔壁菌門的差異及功能。Skennerton等[19]認(rèn)為，柔膜菌綱細(xì)菌由于沒有完整的三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化，只能進(jìn)行底物水平磷酸化產(chǎn)生ATP供其生長發(fā)育，柔壁菌綱在提高飼料效率方面的主要作用可能是參與宿主或其他細(xì)菌在生物合成過程中產(chǎn)生的高能磷酸化合物進(jìn)行自身及宿主的生命活動(dòng)，提高宿主代謝水平，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化。目水平的梭菌目在高飼料效率組中的豐度高于低飼料效率組，其科水平的梭菌科（梭菌科與肥胖有關(guān)[20]）、屬水平的SMB53在高、低飼料效率組中均達(dá)到差異極顯著水平，SMB53為梭菌科的一個(gè)屬，目前其只有相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果表述[21-22]，但無相關(guān)功能描述，其可能與肉雞的飼料效率有關(guān)，因此SMB53在影響飼料效率方面的功能有待進(jìn)一步探索。梭菌科為梭菌綱一個(gè)分支，梭菌綱隸屬于厚壁菌門，厚壁菌門、梭菌科、SMB53均體現(xiàn)在高飼料效率組中，SMB53可能是影響快大型黃羽肉雞飼料效率的重要菌屬，且是微量的、高效的。屬水平除SMB53外，還有24種菌屬在高、低飼料效率組糞便微生物中差異極顯著，其中17種菌屬在低飼料效率組種的豐度極顯著高于高飼料效率組，7種菌屬在高飼料效率組中的豐度要極顯著高于低飼料效率組；12種菌屬達(dá)差異顯著水平，其中，4種菌屬在低飼料效率組顯著高于高飼料效率組，5種菌屬在高飼料效率組顯著高于低飼料效率組，且這些差異極顯著及差異顯著的菌屬在糞便微生物中的豐度均不高（豐度＜0.1%）。在低飼料效率組顯著和極顯著高于高飼料效率組的菌屬中，有42.31% 來自變形菌門，其中63.64% 為α變形菌綱。這種差異分布與遺傳背景相同的快大型黃羽肉雞的飼料效率有關(guān)，且對宿主飼料效率的影響是微效的，糞便微生物在宿主體內(nèi)的豐度和分布對宿主飼料效率的作用有待進(jìn)一步發(fā)掘。

3.3 種水平差異菌群 本研究結(jié)果在種水平指出在分布微生物中豐度較高的3種細(xì)菌，即大腸埃希氏桿菌（LFE：17.97%，LFE：19.00%）、盲腸球菌（HFE：7.38%，LFE：5.62%）和糞腸球菌（HFE：4.23%，LFE：5.81%）。大腸埃希氏桿菌是腸道常見的菌群。Benevides-Matos等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大腸艾希氏桿菌與嬰幼兒腹瀉有關(guān)。大腸艾希氏桿菌在低飼料效率組雞只的較高豐度可能是影響個(gè)體對飼料效率轉(zhuǎn)化的主要原因之一。至今對盲腸球菌生物學(xué)功能及生態(tài)學(xué)等了解甚少，其在飼料效率方面的作用還有待進(jìn)一步挖掘。糞腸球菌可降低機(jī)體三?；视?、磷脂、膽固醇酯含量，使內(nèi)臟脂肪組織中脂連素表達(dá)上調(diào)，皮下及內(nèi)臟脂肪組織對胰島素敏感性增加且炎癥減少，增加肌肉質(zhì)量[24]。因此，在種水平豐度較高的3種菌是影響黃羽肉雞飼料效率的主效菌。種水平有10個(gè)存在差異菌種，其中4個(gè)菌種（Psychrobacter pulmonis、Pseudomonas viridif l ava、Clostridium perfringens、Lactobacillus agilis）差異達(dá)極顯著水平，6個(gè)菌種（Mycoplasma hyorhinis、Roseomonas aerilata、Sphingopyxis alaskensis、Haemophilus parainfluenzae、Acinetobacter rhizosphaerae、Eubacterium dolichum）達(dá)差異顯著水平，且該10個(gè)菌種在個(gè)體糞便微生物含量極微，在高飼料效率組中Eubacterium dolichum含量高于低飼料效率組61倍，其對機(jī)體得出作用尚未見報(bào)道，但推測其對于飼料消化吸收代謝有促進(jìn)作用，從而導(dǎo)致菌種在含量上呈顯著差異。其余9種顯著差異菌群由于其含量極微，且含量過高易使機(jī)體產(chǎn)生病理反應(yīng)，它們與機(jī)體的互作關(guān)系是微妙的，具體作用與合適菌群豐度有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在相同的遺傳背景與飼養(yǎng)條件下，高、低飼料效率組黃羽肉雞的糞便微生物菌群優(yōu)勢菌群種類一致，但豐度存在差異，且該差異分布與飼料效率有關(guān)。厚壁菌門是影響飼料效率的優(yōu)勢菌門，厚壁菌門、擬桿菌門及柔壁菌門的相互作用在宿主飼料效率轉(zhuǎn)化方面起到重要作用。厚壁菌門的梭桿菌綱、梭菌目、梭菌科中的SMB53可能是影響飼料效率的重要菌屬。