李志強(qiáng)，徐高青，石麗穎，王 軍，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林省反芻動(dòng)物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室， 吉林長(zhǎng)春 130118）

褪黑素（Melatonin，MT）主要是由松果體合成和分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，化學(xué)成分是N-乙?；?5-甲氧基色胺。近年來(lái)，大量文獻(xiàn)表明MT具有控制生理節(jié)律、抗衰老、抗炎和抗細(xì)胞凋亡等多種生理功能[1-2]。MT不僅可抑制小鼠心肌細(xì)胞及椎體終板軟骨細(xì)胞的凋亡[3-4]，還可促進(jìn)人NB4及大腸癌細(xì)胞凋亡[5-6]，即MT具有雙向作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞有促凋亡作用，對(duì)正常細(xì)胞有抗凋亡作用。MT主要通過(guò)激活2種膜受體MT1和MT2調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能[7]。核受體RORα是視黃酸相關(guān)孤兒核受體的一員，在多種組織的分化和發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[8]，而MT已經(jīng)被證明是RORα的天然配體，被稱為褪黑素核受體RORα[9]。有證據(jù)表明，MT的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用主要是通過(guò)RORα途徑發(fā)揮作用[10-11]，RORα在調(diào)節(jié)生物鐘及睪酮分泌中也起著重要作用，而最近Gulec等[12]研究發(fā)現(xiàn)，RORα在人THP-1細(xì)胞中參與了細(xì)胞凋亡，但RORα在MT抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究核受體RORα對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 本實(shí)驗(yàn)采用小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3，用5%馬血清、2.5%胎牛血清及1%雙抗為培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。提前1 d傳代TM3細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)血清培養(yǎng)液（對(duì)照組）、MT、MT+核受體RORα拮抗劑SR1001、SR1001處理小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞36 h。

1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 在已處理好的細(xì)胞中加入5% MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后棄掉上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩至結(jié)晶消失，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀吸光度490 nm處檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 按照BD公司凋亡檢測(cè)試劑盒要求，將處理好的細(xì)胞用PBS洗1遍，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入 200 μL 1×Buffer及碘化丙啶(PI)、異硫氰酸熒光素（FITC）各5 μL，放置培養(yǎng)箱中孵育20 min ，再加入 200 μL 1×Buffer，過(guò)濾至流式管中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá) 采用RNAiso Plus法提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，檢測(cè)RNA的濃度及OD 值，每1 μg RNA反轉(zhuǎn)20 μL 體系的cDNA。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl2、Bax基因引物序列見(jiàn)表1。引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，并利用 PCR 儀進(jìn)行引物驗(yàn)證，尋找引物的最適反應(yīng)條件。利用熒光定量PCR檢測(cè)在不同處理TM3的情況下Bcl2、Bax的mRNA表達(dá)量，熒光定量PCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL（1×）、 Forward primer 0.8 μL（0.2 μmol/L）、Reverse primer 0.8 μL（0.2 μmol/L）、 ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，59℃退火34 s，95℃復(fù)性15 s，擴(kuò)增 40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較組間差異性，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示顯著差異，P＜0.01 表示極顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力 如圖1所示，與對(duì)照組相比，加入MT可以極顯著提高小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力（P＜0.01），MT+SR1001組細(xì)胞活力較MT組顯著下降（P＜0.05），SR1001組細(xì)胞活力與對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明拮抗劑自身對(duì)細(xì)胞活力不產(chǎn)生影響。

圖1 MTT法檢測(cè)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞活力

2.2 細(xì)胞凋亡率 如圖2所示，與對(duì)照組相比，添加MT可以顯著降低小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），MT+SR1001組細(xì)胞凋亡率較MT組極顯著上升（P＜0.01），RORα組與對(duì)照組沒(méi)有差異，說(shuō)明拮抗劑自身對(duì)細(xì)胞凋亡不產(chǎn)生影響。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率

2.3 凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 如圖3所示，與對(duì)照組相比，加入MT后，可上調(diào)Bcl2（P＜0.01）、下調(diào)Bax基因的表達(dá)水平（P＜0.05）；與MT組相比，MT+SR1001可上調(diào)Bax基因的表達(dá)水平（P＜0.05），Bcl2基因則極顯著下降（P＜0.01）；SR1001組Bcl2、Bax基因的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明拮抗劑自身對(duì)細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)不產(chǎn)生影響。

圖3 Bcl2、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

MT可通過(guò)膜受體MT1和MT2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[7]，但RORα是否參與這一過(guò)程尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，MT可抑制細(xì)胞凋亡提高細(xì)胞活力，添加SR1001后，間質(zhì)細(xì)胞凋亡率又顯著上升，細(xì)胞活力顯著下降，這些結(jié)果提示MT可通過(guò)核受體RORα途徑抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

有關(guān)RORα在MT抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，但對(duì)其他細(xì)胞的研究證明MT可通過(guò)RORα調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能。He等[13]在研究RORα在MT保護(hù)心肌中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，RORα表達(dá)降低會(huì)促進(jìn)心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷和自噬功能障礙，增加心肌梗死面積，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證明RORα是作為MT保護(hù)心臟的重要介質(zhì)。Coban等[12]研究表明，RORα在細(xì)胞凋亡中起著重要作用，其通過(guò)各種途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，用蛋白激酶（AMPK）激活劑AICAR處理可提高RORα表達(dá)，導(dǎo)致人胃癌細(xì)胞凋亡，并證明RORα是胃癌介入治療的潛在靶點(diǎn)。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RORα通過(guò)P53調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡，并闡明RORα通過(guò)調(diào)節(jié)p53功能發(fā)揮潛在抑癌作用的機(jī)制。同樣，Deng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊的精原干細(xì)胞中，添加RORα拮抗劑后會(huì)導(dǎo)致單倍體精子細(xì)胞的形成及類固醇激素的生成顯著降低。Zhao等[17]在研究?jī)?nèi)蒙古絨山羊毛囊中沒(méi)有檢測(cè)到褪黑素膜受體的表達(dá)，但檢測(cè)到RORα的表達(dá)，并證明MT可通過(guò)RORα促進(jìn)絨山羊毛囊的生長(zhǎng)。Garcia等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RORα缺乏導(dǎo)致糖尿病引起的心臟舒張功能障礙顯著增加，相比之下，RORα水平恢復(fù)后顯著改善了心臟功能。這些研究都證明MT可通過(guò)RORα發(fā)揮作用，與本研究的結(jié)果一致。本研究結(jié)果證明MT可通過(guò)RORα途徑抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。