姚榮妹，毛鑫，包蕾，高英杰，王彥禮，崔曉蘭

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700)

艾康片是由川芎、茯苓、靈芝、金銀花、野菊花、苦參、甘草等13味藥組成的中藥復方，我們前期對其進行了大量的中藥組方篩選和藥理藥效研究，發(fā)現(xiàn)艾康片可以增強機體免疫功能，在抗腫瘤(肺)方面表現(xiàn)出很好的藥效作用。提取工藝是中藥復方制備的關鍵環(huán)節(jié)，直接影響臨床療效，為進一步篩選艾康片最佳的工藝提取方法，我們根據(jù)其臨床適應癥設計了相應的藥效學實驗，為其進一步工藝路線的確定和工藝參數(shù)的選擇提供參考。本實驗利用裸小鼠建立移植性肺癌動物模型[1-3]，結合體內抗腫瘤的藥效學評價方法，觀察艾康片3種提取工藝在抑制肺部腫瘤生長方面的效果。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞株

BALB/CA-nu品系的裸小鼠，體質量(19±1)g，雌雄各半，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。A549人小細胞肺癌傳代細胞，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心。

1.2 藥品及試劑

艾康片提取物，中國中醫(yī)科學院中藥研究所中藥制劑研究中心提供，批號：20160912-1、20160912-2、20160912-3，規(guī)格：200 mL/瓶；復方環(huán)磷酰胺片，購自通化茂祥制藥有限公司，批號：160702。PBS磷酸緩沖液(美國Gibco，批號1789842)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco，批號8116489)；胎牛血清(美國Gibco，批號1390781)；雙抗(美國Hyclone，批號J130061)；0.25%胰酶(美國Gibco，批號1616025)。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific，Thermo-371)；潔凈工作臺(美國AIRTECH，SW-CJ-2FD)；離心機(德國Eppendorf，5810R)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，CKX41)；高溫蒸汽滅菌器(ALP，CLG-32L)；自動細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，countstar-IC1000)；電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204)；數(shù)顯卡尺(上海恒勝工具有限公司，METR-ISO)。

2 實驗方法

2.1 劑量設計

艾康片成人臨床推薦劑量為7.6 g生藥/60(kg·d)，換算成裸小鼠等效用量為1.4 g/(kg·d)。實驗中采用2.8、1.4、0.7 g/(kg·d)3個劑量組(分別相當于人臨床用量的2倍、等倍、1/2倍)。該藥3種提取工藝含藥量均為2 g生藥/mL，故3種提取物高、中、低劑量為1.4 mL/(kg·d)、0.7 mL/(kg·d)、0.35 mL/(kg·d)。復方環(huán)磷酰胺片成人臨床推薦劑量175 mg/60(kg·d)，實驗中小鼠用量按人用量的11倍計算，小鼠的給藥劑量為32 mg/(kg·d)。

2.2 人肺腺癌細胞株(A549)的培養(yǎng)

細胞株培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液， 37℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內，細胞培養(yǎng)至80%～90%融合率，0.25%胰蛋白酶消化，離心后傳代，待細胞培養(yǎng)至一定數(shù)量，用PBS稀釋成腫瘤細胞懸液接種于實驗動物體內。

2.3 細胞體外活性檢測及腫瘤細胞懸浮液的制備

在無菌條件下取生長良好的A549腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化、離心后，用PBS混懸細胞，采用臺盼藍染色法，使用全自動細胞計數(shù)儀檢測細胞活性并計數(shù)。用PBS稀釋成2×107個細胞/mL濃度的腫瘤細胞懸浮液。

2.4 制備人肺癌移植瘤模型

在無菌條件下，將裸鼠用75%乙醇皮膚消毒后，在裸鼠右腋皮下接種人肺腺癌A549細胞懸液，0.2 mL/只，接種后定期觀察小鼠的精神、飲食及排便等情況。接種1周左右，可見接種部位皮下長出小米粒大小的硬結，為移植瘤模型建成。

2.5 分組及給藥

待腫瘤生長至100 mm3左右，挑選瘤塊、體質量均勻的裸小鼠，隨機分為11組，分別為模型對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組、艾康1號高、中、低3個劑量組、艾康2號高、中、低3個劑量組、艾康3號高、中、低3個劑量組，每組7只，分組當天開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)21 d，給藥容積為0.2 mL/10 g。

2.6 觀察指標及計算方法

平均瘤重、腫瘤生長抑制率、腫瘤體積、相對腫瘤體積、相對腫瘤增殖率。

腫瘤體積(tumor volume,TV)：TV=1/2×a×b2或π/6×a×b×c，其中a、b、c分別表示長寬高。

相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)：RTV=Vt/V0，其中V0為給藥前測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。

相對腫瘤增殖率T/C(%)：T/C%=TRTV/CRTV×100%，(TRTV為治療組RTV；CRTV為陰性對照組RTV)。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結果

3.1 對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長情況的影響

艾康片3種工藝樣品在給藥2 d后起腫瘤體積與模型對照組比較均有所下降，給藥組裸鼠腫瘤體積的生長曲線均位于模型對照組下方。2號、3號樣品在給藥8～20 d后腫瘤體積與模型對照組比較明顯下降(P<0.01,P<0.05)，1號樣品在給藥12～20 d后腫瘤體積與模型對照組比較明顯下降(P<0.01,P<0.05)，其中3號藥品中劑量組腫瘤體積在給藥4～20 d后5個檢測時間點與模型對照組比較均有差異(P<0.01)，從數(shù)值上看差異也最為顯著。(見表1、圖1)。

圖1 艾康片治療后腫瘤體積生長曲線

圖2 艾康片對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠相對腫瘤增殖體積的影響

3.2 對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠相對腫瘤增殖體積(RTV)及相對腫瘤增殖率的影響

艾康3號中劑量組的相對腫瘤增殖體積在給藥期間與模型對照組比較有差異(P<0.05)，其余各用藥組與模型組無差異。與模型對照組比較，艾康1號高劑量組、艾康2號高劑量組、艾康3號中劑量組的相對腫瘤增殖率在28%～70%之間，艾康1號中劑量組和艾康1號低劑量組相對腫瘤增殖率在給藥前16 d均高于模型組，其余用藥組的相對腫瘤增殖率在50%～90%之間。見圖2、圖3。

3.3 對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠相對腫瘤重量的影響

艾康片各劑量組瘤塊重量與模型對照組比較均有差異(P<0.01)，艾康3號中劑量組腫瘤塊重量最小,見表2。

表1 艾康片對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長情況的影響

續(xù)表1 艾康片對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤體積生長情況的影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 艾康片對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠相對腫瘤增殖率的影響

表2 艾康片對人肺腺癌細胞株(A549)裸小鼠模型腫瘤重量的影響

注：與模型對照組比較，**P<0.01

4 討論

肺癌已成為世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率還在持續(xù)增加[4-6]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署2015年發(fā)布的GLOBOCAN癌癥報告顯示，預測到2025年，中國每年新增肺癌病例將超過100萬，將成為全球肺癌患者最多的國家。因此，抗肺癌藥物的研究開發(fā)在我國顯得尤為迫切，也是為當前的科研熱點之一。中國是天然藥物資源大國，從積累了數(shù)千年臨床經驗的中草藥寶庫中發(fā)掘有效的抗腫瘤新藥是我國醫(yī)藥界的重要研究方向。艾康片從經典古方化裁而來，方中川芎之類活血通脈，茯苓之類補肺脾，靈芝補氣安神，金銀花、野菊花之類清熱解毒，甘草調和以上藥物的烈性兼?zhèn)渲雇垂π?，諸藥合用共奏活血化瘀、補氣寧心、清熱解毒、滋補強身之功，具有抑制腫瘤生長，改善機體不適癥狀，增強機體免疫功能的作用。

將人類肺癌細胞系移植到免疫缺陷動物皮下是對惡性腫瘤進行體內實驗研究的首選方法[7]。裸鼠移植性肺癌動物模型是把肺癌組織塊或肺癌細胞系接種于實驗動物體內形成的荷瘤動物模型，主要包括異位移植、原位移植和轉基因動物模型三類。目前常用的肺癌細胞系包括人肺腺癌A549、SPC-A-1、Calu-3、LTEP-a-2、人肺扁平上皮癌QG-56、人高轉移肺癌95-D、人肺癌大細胞系NCI-H460以及人肺癌小細胞系NCI-H446等[8]。本研究在裸小鼠右腋皮下接種人肺腺癌A549細胞懸液制備肺癌移植瘤模型，觀察艾康片3種提取物的抑瘤作用。實驗結果顯示，3種提取樣品均有降低裸鼠腫瘤體積、相對腫瘤增殖體積、腫瘤增殖率、腫瘤重量的作用，其中3號樣品中劑量組腫瘤體積明顯減小，是僅有的在相對腫瘤增殖體積方面與模型對照組比較有差異的用藥組，其相對腫瘤增殖率在給藥8 d后在40%以下，且瘤塊重量最小。上述藥效學研究數(shù)據(jù)提示，3號樣品制劑在抑制腫瘤方面有效、劑型合理，且未表現(xiàn)出明顯毒副作用，該樣品的提取工藝有推廣應用價值。