張久旭，劉洋，李夢(mèng)薇，顧文宏，龍興芬，趙保勝*

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.云南天佑科技開發(fā)有限公司，云南 芒市 678400)

辣木為多年生速生樹，原產(chǎn)于印度，又稱為鼓槌樹，奇跡之樹，全世界約有14個(gè)品種[1]。辣木葉粉含有豐富的維生素、蛋白質(zhì)以及氨基酸，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為“人類營(yíng)養(yǎng)的微型寶庫”的螺旋藻相當(dāng)[2]，在食品領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，近些年在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也越來越受歡迎，調(diào)查顯示，辣木葉粉有降血糖、降脂、降壓、改善睡眠等功效，長(zhǎng)期食用可增強(qiáng)人體免疫功能，延緩衰老、預(yù)防疾病。在印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究中，辣木葉性涼，具有通便、促進(jìn)消化的作用[3]。賀銀鳳等人研究也表明了辣木葉具有明顯的通便作用[4]。

辣木復(fù)方葉由辣木葉、黃芪、白術(shù)組成，臨床應(yīng)用具有較好的通便作用。本實(shí)驗(yàn)在臨床研究基礎(chǔ)上，觀察辣木葉復(fù)方對(duì)便秘模型小鼠的通便作用，并觀察黃芪、白術(shù)與辣木葉的協(xié)同作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

辣木葉：由合作企業(yè)(云南天佑科技開發(fā)有限公司)提供；黃芪(批號(hào)：1611020，北京太洋樹康中藥飲片廠)；白術(shù)(批號(hào)：1609003，北京太洋樹康中藥飲片廠)；硫糖鋁(批號(hào)：11403077，北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司)；曙紅(批號(hào)：E100232，北京伊諾凱科技有限公司)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司，批號(hào)：164790)；甲醇(分析純，北京化工廠，批號(hào)：20170209)；磷酸(分析純，北京化工廠，批號(hào)：20160111)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)：201102GQ07547)；異槲皮苷(純度92.9%，111809-201403,中國(guó)食品藥品檢定研究院)；紫云英苷(純度99.5%，批號(hào)：Y27J7H9634,上海源葉生物科技有限公司)；蘆丁(純度98%，批號(hào)：170124，北京四面體生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物的制備方法

實(shí)驗(yàn)分組：辣木葉低劑量組(10 g/d)、辣木葉中劑量組(15 g/d)、辣木葉高劑量組(20 g/d)，黃芪白術(shù)組10g/d，復(fù)方組合①(辣木葉10 g/d+黃芪白術(shù)(10 g/d)、復(fù)方組合②(辣木葉15 g/d+黃芪白術(shù)10 g/d)、復(fù)方組合③(辣木葉20 g/d+黃芪白術(shù)10 g/d)

辣木葉干燥粉末：稱取辣木葉97.93 g于2 000 mL圓底燒瓶，加100 mL蒸餾水，浸泡2 h?；亓魈崛? h，保持微沸狀態(tài)，用紗布過濾，收集初濾液，再加入1 000 mL蒸餾水，回流提取2 h，合并2次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，將濃縮后的藥液倒入蒸發(fā)皿中，移至60℃真空干燥箱中干燥至恒重，冷卻至室溫，得到辣木葉干燥粉末。

復(fù)方干燥粉末：以2倍處方量稱取各藥材，按不同的實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行水回流提取，紗布過濾，放置過夜，濾去沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，得濃縮液，60℃水浴濃縮至流浸膏，得到不同復(fù)方干燥粉末。

1.1.3 化學(xué)試劑及其配制

硫糖鋁混懸液配制：取硫糖鋁試劑0.2 g，取0.5 g羧甲基纖維素鈉，加入100 mL水，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的溶液。

曙紅溶液配制：取1 g曙紅，加入100 mL去離子水溶解，得到澄清、朱紅色的溶液。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠100只(由北京斯貝福生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可正號(hào):SCXK(京)2016-0002)，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。

1.1.5 儀器和設(shè)備

電子分析天平：Sartorius BSA2202S(濟(jì)南恒則成儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋：XMTD-6000型(濟(jì)南溫騰醫(yī)療器械有限公司)；真空干燥箱：TAISITED 2-2BC型(上海索普機(jī)械有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810，普析)；島津高效液相色譜儀(LC-16，日本島津公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總黃酮含量的測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁14.94 mg，加入70%乙醇溶液超聲溶解，定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入25 mL刻度比色管中，加入30%乙醇至5 mL，后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，30%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后用1 cm比色皿在510 nm處測(cè)定吸光度。

以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蘆丁的線性回歸方程為y=0.001 3x-0.027 3，r2=0.999 9，蘆丁濃度在73.21～585.54 μg/mL范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。如圖1所示。

圖1 蘆丁線性回歸方程

2.1.2 樣品總黃酮含量測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，各精密稱取0.25 g不同樣品干燥粉末，每個(gè)樣品平行稱取6份，加入25 mL 70%乙醇溶液，超聲30 min溶解，冷卻，補(bǔ)足稱重。準(zhǔn)確吸取1 mL移入25 mL比色管中，按“2.1.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

取1 mL供試品溶液至25 mL比色管中，按“2.1.1項(xiàng)下”操作，連續(xù)6次測(cè)定吸光度，RSD值為0.14%，表明儀器的精密度良好，可以滿足含量測(cè)定的要求。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取適宜濃度的對(duì)照品溶液和供試品溶液于0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h測(cè)量吸光度，RSD值分別為1.45%和1.47%，表明對(duì)照品和樣品在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取供試品約0.5 g，按照供試品的制備方法制備樣品6份，按照“2.1.1項(xiàng)下”測(cè)定吸光度，以吸光度計(jì)算RSD值為1.83%。說明本測(cè)定的方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

取裝量差異下的木葉通便復(fù)方②6份，各0.25 g，精密稱定，加入蘆丁適量，按照供試品制備方法制備樣品。測(cè)定吸光度，計(jì)算各對(duì)照品的平均加樣回收率和RSD值。結(jié)果見表1。

表1 辣木葉通便復(fù)方回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2 指標(biāo)性成分的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

分別取異槲皮苷對(duì)照品10.00 mg、紫云英苷對(duì)照品10.60 mg置10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得異槲皮苷濃度為1.00 mg/mL和紫云英苷濃度1.06 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液。分別吸取異槲皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液4.8 mL和紫云英苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.2 mL于10 mL容量瓶中定容至刻度作為混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別取不同辣木葉通便復(fù)方樣品、辣木葉單味樣品、黃芪白術(shù)組樣品粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各精密加入50 mL甲醇，稱重。超聲(300 W,40 kHz)溶解30 min后取出，放冷，稱重，加入純甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，靜置，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得各組供試品溶液。

2.2.3 色譜條件

色譜柱為Cosmosil-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～16 min 20%B,16～28 min 20%～50%B,18～22 min 50%B,22～23 min 50%～20%B,30 min 20%B；流速為1.3 mg/mL，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。進(jìn)樣量為10 μL，上述色譜條件下，分析對(duì)照品和樣品。

2.3 通便實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法

取ICR小鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組，辣木葉低劑量組(10 g/d)、辣木葉中劑量組(15 g/d)、辣木葉高劑量組(20 g/d)，黃芪白術(shù)組(10 g/d)，復(fù)方組合①(辣木葉10 g/d+黃芪白術(shù)(10 g/d)、復(fù)方組合②(辣木葉15 g/d+黃芪白術(shù)10 g/d)、復(fù)方組合③(辣木葉20 g/d+黃芪白術(shù)10 g/d)，每組10只小鼠。

2.3.2 小鼠便秘模型的建立

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠正常飲水， 除空白組外各組小鼠均灌以質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的硫糖鋁混懸溶液。 每天按 0.5 mL/只灌胃小鼠 1 次，連續(xù) 3 d ，第 4 天劑量減半，結(jié)果模型組小鼠出現(xiàn)首粒排便時(shí)間延長(zhǎng)，4 h內(nèi)排便粒數(shù)減少等表現(xiàn)。

2.3.3 辣木葉通便實(shí)驗(yàn)

第4天分別給各組小鼠稱重，并記錄體質(zhì)量。灌胃給藥硫糖鋁2 h后，按體質(zhì)量給實(shí)驗(yàn)組給藥。 陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組每只小鼠灌以 0.5 mL蒸餾水, 灌制的液體中均混有曙紅溶液, 以便更好地觀測(cè)糞便顏色。各組小鼠單籠分養(yǎng), 正常飲水、進(jìn)食, 分別觀察記錄每只小鼠首次排出紅便時(shí)間和4 h內(nèi)排便數(shù)量以及糞便干燥后的重量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果與分析

3.1 各樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

從總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果來看，通便復(fù)方中的總黃酮主要來源于辣木葉，但經(jīng)黃芪、白術(shù)配伍后，總黃酮含量明顯增多，并且以復(fù)方組合②增加的最明顯。各樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3.2 各樣品指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果

從高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果來看，按日服用生藥量計(jì)算，通便復(fù)方中選定的指標(biāo)性成分異槲皮苷和紫云英苷的含量分別為61.699 mg,31.796 mg，辣木葉單味藥中異槲皮苷和紫云英苷的含量分別為40.386 mg,21.412 mg，復(fù)方中異槲皮苷和紫云英苷含量較辣木葉單味藥分別多21.313 mg,10.384 mg。各樣品指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 各樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果(n=6)

表3 各樣品指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.3 小白鼠便秘模型的建立

除空白組外其它各組小白鼠灌胃硫糖鋁混懸液0.5 mL，有效成分濃度為2 mg/mL。空白對(duì)照組小鼠灌胃等量蒸餾水,觀測(cè)小白鼠排首便的時(shí)間。從表1可以看出,灌胃硫糖鋁的陰性對(duì)照組首次平均排便時(shí)間為104.80 min，灌胃蒸餾水的空白對(duì)照組首便平均時(shí)間為36.3 min，相差68.5 min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)?？梢员砻鞅忝啬Ｐ统晒5-6]。

3.4 辣木葉及其復(fù)方對(duì)便秘模型小鼠首便時(shí)間的影響

在成功建立便秘模型的基礎(chǔ)上,對(duì)小鼠進(jìn)行通便實(shí)驗(yàn)研究,并設(shè)蒸餾水陰性對(duì)照組，結(jié)果見表4。由表中數(shù)據(jù)可以看出,通過陰性對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組的比較,多數(shù)實(shí)驗(yàn)組首便時(shí)間明顯縮短，辣木葉及其復(fù)方與黃芪白術(shù)組對(duì)小鼠首便時(shí)間均有顯著有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三者均對(duì)小鼠的首次排便時(shí)間有作用，但復(fù)方2的作用效果明顯高于其他試驗(yàn)組(P<0.001)。

3.5 辣木葉及其復(fù)方對(duì)便秘模型小鼠排便量的影響

測(cè)定各組小鼠在灌胃給藥后4 h內(nèi)排便粒數(shù)和干糞便的重量,辣木葉及其復(fù)方對(duì)排便粒數(shù)及糞便干重影響顯著，但黃芪白術(shù)組對(duì)排便粒數(shù)及糞便干重影響不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對(duì)便秘小白鼠的排便量均有顯著的影響。

表4 辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對(duì)小鼠通便作用的影響

注：與模型組比較，**P<0.01,*P<0.05

4 討論

便秘為大腸傳導(dǎo)功能失常所致，但與脾胃肝腎等臟腑的功能失調(diào)有關(guān)。目前隨著人們生活節(jié)奏的加快和飲食結(jié)構(gòu)的改變，便秘患者日益增多，相當(dāng)一部分便秘患者就診前曾受廣告影響、他人介紹而自行選擇瀉劑治療其便秘，這種沒有專業(yè)基礎(chǔ)作指導(dǎo)的用藥，常常發(fā)生不合理用藥的情況，引起一些原本可避免的副反應(yīng)[7]。

目前對(duì)辣木葉通便作用的研究也有諸多報(bào)道，但對(duì)辣木葉復(fù)方通便作用的研究還未見報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)以小鼠首便時(shí)間和4 h內(nèi)糞便的粒數(shù)和干燥后的重量為指標(biāo)，研究辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對(duì)小鼠通便作用的影響。結(jié)果顯示，辣木葉及其復(fù)方灌胃給藥對(duì)便秘小鼠具有明顯的通便作用，即明顯縮短小鼠首便時(shí)間并且增加了小鼠的排便重量，且辣木葉復(fù)方組②(辣木葉15 g/d+黃芪白術(shù)10 g/d)的整體通便作用更為明顯。

經(jīng)過研究與查閱文獻(xiàn)可知，辣木葉主要含有黃酮類化合物[8-9]，本次實(shí)驗(yàn)選擇了異槲皮苷和紫云英苷為指標(biāo)性成分，二者均為黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[10-11]，有研究表明，具有抗氧化、抗炎作用的藥物和天然產(chǎn)物能夠保護(hù)腸黏膜的完整性，促進(jìn)慢性傳輸型便秘腸道功能的恢復(fù)[12-13]。通便復(fù)方中的總黃酮主要來源于辣木葉，但經(jīng)黃芪、白術(shù)配伍后，總黃酮含量明顯增多，并且此差值比黃芪、白術(shù)二味藥配伍后總黃酮值高出6倍，可能是由于辣木葉通便復(fù)方中黃芪含有大量皂苷類成分，有助溶性，可促進(jìn)其他成分在水中的溶解度，配伍之后的黃酮含量明顯增加，并且復(fù)方中指標(biāo)性成分含量也顯著增加，從而說明復(fù)方中各藥的化學(xué)成分在提取制備過程中，對(duì)其他成分產(chǎn)生助溶作用，可以在一定程度上表明復(fù)方配伍的優(yōu)越性，同時(shí)也側(cè)面佐證了辣木葉通便復(fù)方的通便作用?？傸S酮及異槲皮苷和紫云英苷的含量測(cè)定結(jié)果結(jié)合通便藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉通便復(fù)方配伍較單味辣木葉、去辣木葉復(fù)方具有更高含量黃酮類成分，為其藥效提供了一定的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支撐，為辣木葉復(fù)方的進(jìn)一步深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。