李巖， 程洪杰，李克明

(1.山東省新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安 271200；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

目前臨床上大部分乙肝抗病毒西藥的副作用較大，故中草藥及其復(fù)方制劑成為對乙肝治療起協(xié)同增效、降低毒副作用的主要輔助藥物[1]。本實驗中乙肝扶正清毒顆粒(魯藥制再注20090419)由柴胡、赤芍、炒白術(shù)等18味中藥復(fù)方組成，是我院在二十余年臨床應(yīng)用經(jīng)驗基礎(chǔ)上研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，以扶正解毒、疏肝健脾、涼血化淤為中醫(yī)配伍原則，臨床上主要治療乙型肝炎、早期肝硬化以及毒邪壅滯、氣陰兩虛型乙肝。

赤芍為制劑中君藥，其含芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等成分，具有抗血栓、降脂、抗動脈硬化、抗腫瘤和保肝等作用[2-3]。為了更好地對乙肝扶正清毒顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，保證其在臨床應(yīng)用中更加安全有效，本文對制劑中所含主要成分芍藥苷進(jìn)行HPLC含量測定的方法學(xué)研究。目前大多數(shù)相關(guān)文獻(xiàn)是以藥典方法為基礎(chǔ)，對中藥復(fù)方制劑中芍藥苷提取和含量測定進(jìn)行研究，雖然該法適用性較好，但乙肝扶正清毒顆粒藥味較多且含有大量糖類，對芍藥苷提取率和含量測定形成干擾。因此，本實驗優(yōu)化了芍藥苷的提取和含量測定方法，為該制劑的質(zhì)控提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；CP114電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；KQ-1000E超聲清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；UPH-I-5/10/20TN超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑為分析純；水為超純水。

1.3 試藥

芍藥苷(批號110736-201438，中國食品藥品檢定研究院，含量為96.4%)；乙肝扶正清毒顆粒及陰性樣品(根據(jù)處方工藝自制)；處方藥材(上海雷允上中藥飲片廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 樣品供試溶液制備

供試品溶液制備：取符合制劑裝量差異標(biāo)準(zhǔn)的本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液25 mL，塞緊瓶塞，精密稱定，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，置冷，加50%乙醇溶液補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品供試液的制備

精密稱取芍藥苷對照品10.04 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，完全溶解，搖勻，精密吸取5 mL上述溶液，置25 mL容量瓶，以50%乙醇溶液定容到刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為40.16 μg/mL的供試對照品溶液。

2.4 陰性對照樣品供試液的制備

取不含赤芍的其他藥味及輔料，根據(jù)乙肝扶正清毒顆粒的處方制備工藝，制成不含赤芍的陰性空白對照品，再按2.2項下樣品供試液制備方法進(jìn)行提取，即得陰性對照品供試液。

2.5 樣品提取條件優(yōu)化

2.5.1 提取溶劑考察

根據(jù)李思雨等[3-4]的方法，分別設(shè)置50%乙醇溶液、80%乙醇溶液、甲醇溶液3組溶劑，對供試品溶液提取方法中提取溶劑進(jìn)行考察，對照品為2.3項下，色譜條件為2.1項下。結(jié)果見表1。

表1 提取溶劑考察

由表1可知，采用3種不同溶劑對樣品中芍藥苷進(jìn)行提取，計算含量，結(jié)果表明，以50%乙醇溶液的提取率最高，故選用50%乙醇溶液作為提取溶劑。

2.5.2 提取體積考察

分別設(shè)置50 mL、25 mL、15 mL 3組50%乙醇溶液，對供試品溶液提取方法中提取溶劑體積進(jìn)行考察，對照品為2.3項下，色譜條件為2.1項下。結(jié)果見表2。

由表2可知，以樣品中芍藥苷含量為指標(biāo)，加入25 mL 50%乙醇溶液，即可將指標(biāo)成分提取充分，故選用25 mL 50%乙醇溶液進(jìn)行提取。

2.5.3 提取時間考察

分別設(shè)置15、30、60 min 3組提取時間，對供試品溶液提取方法中提取時間進(jìn)行考察，對照品為2.3項下，色譜條件為2.1項下。結(jié)果見表3。

表3 提取時間考察

由表3可知，以樣品中芍藥苷含量為指標(biāo)，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min即可將測定成分提取充分，故選用超聲(功率240 W，頻率45 kHz)30 min處理樣品。

2.6 色譜方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察

取經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾的上述各供試液，分別通過2.1項下色譜條件進(jìn)行分析測定，結(jié)果顯示供試品溶液與芍藥苷對照品溶液的色譜峰在相同的保留時間內(nèi)有相同的色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照溶液在此保留時間處無干擾色譜峰出現(xiàn)，說明乙肝扶正清毒顆粒供試液中其他成分對芍藥苷的分析測定不形成干擾，表明本實驗方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

圖1 乙肝扶正清毒顆粒芍藥苷測定專屬性實驗HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of exclusive experiment of paeoniflorin in Yiganfuzhengqingdu Granules

2.6.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積A對進(jìn)樣質(zhì)量M(μg)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A=1460M-0.8，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明, 本品芍藥苷溶液在0.079 1～0.988 0 μg之間呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系考察

2.6.3 儀器精密度實驗

精密吸取已知濃度芍藥苷對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件重復(fù)測定6次，記錄峰面積，計算儀器精密度，結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.07%,儀器精密度良好。結(jié)果見表5。

表5 儀器精密度考察

2.6.4 重復(fù)性實驗

取乙肝扶正清毒顆粒(批號20180106)樣品6份，按上述擬定的芍藥苷的含量測定方法制備供試品溶液，精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算芍藥苷的含量，結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%，此方法測定本品中芍藥苷的含量，重復(fù)性良好。結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性實驗考察

2.6.5 穩(wěn)定性實驗

精密吸取乙肝扶正清毒顆粒供試品溶液5 mL，于25 ℃放置0、2、8、12、24 h后分別進(jìn)樣10 μL測定，所測峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.984%，表明供試品溶液25 ℃下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收實驗

芍藥苷對照品儲備液：取芍藥苷對照品適量，精密稱定為8.45 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，精密量取25 mL，置50 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得芍藥苷對照品儲備液(濃度為0.084 5 mg/mL)。

加樣回收實驗供試品溶液的制備：取6份乙肝扶正清毒顆粒(批號20180106)，研細(xì)，混勻，各精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入芍藥苷對照品儲備液5 mL、50%乙醇溶液20 mL，精密稱定，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，置冷，加50%乙醇溶液補(bǔ)重，搖勻，過濾，取濾液，即得。

結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%，此方法測定本品中芍藥苷的含量，加樣回收率良好。結(jié)果見表7。

表7 加樣回收實驗考察結(jié)果(n=6)

2.7 樣品含量測定

取乙肝扶正清毒顆粒5個批號的樣品，每批各3份，按2.2項下方法制備樣品溶液，2.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表8。

表8 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

乙肝扶正清毒顆粒是由枸杞子、赤芍等18味藥材組成，其中赤芍為處方中君藥，結(jié)合文獻(xiàn)[5-7]，赤芍的主要指標(biāo)成分為芍藥苷，其專一性好，含量測定方法成熟，因此將芍藥苷作為該制劑HPLC含量質(zhì)控成分進(jìn)行方法研究。本研究以芍藥苷提取率為依據(jù)，考察了乙肝扶正清毒顆粒供試液的提取方法，對提取溶劑、提取時間、提取溶劑體積進(jìn)行了考察，對比了80%乙醇溶液、50%乙醇溶液、甲醇溶液3種溶劑對提取的影響；對比了15、30、60 min 3種提取時間對提取的影響；對比了15、25、50 mL 3種提取溶劑體積對提取的影響；最終選擇以25 mL 50%乙醇溶液超聲處理30 min的提取方法，該方法提取樣品時時芍藥苷含量高，簡單高效，且雜質(zhì)干擾少。

本研究還對色譜條件的耐用性進(jìn)行了考察，將測定條件進(jìn)行微小變動，對主要變動的色譜條件包括色譜柱溫、波長進(jìn)行了考察，以含量為依據(jù)，考察方法的耐用性，結(jié)果不同波長、色譜柱溫度測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為：2.00%、0.87%，表明本方法耐用性良好。該色譜條件下，讓不同工作人員按照擬定的方法進(jìn)行樣品測定，重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.30%，說明本方法重現(xiàn)性良好。采用大連依利特C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Krimasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3種不同品牌色譜柱依照本法對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aglient色譜柱分離度高且峰形對稱，故選用該型號色譜柱[8-10]。

本研究通過對樣品提取方法和色譜條件的考察，建立了乙肝扶正清毒顆粒中芍藥苷HPLC含量測定的方法。該法分離度高，重現(xiàn)性好，可用于進(jìn)行乙肝扶正清毒顆粒的質(zhì)量控制。