代閆芳 劉素素 岳娟 簡守珺 張芬芬 魏靜靜 司瑋 張紅敏

作者單位：450003 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院、河南省立眼科醫(yī)院、河南省眼科研究所、河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室

雙醋瑞因是白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)抑制劑，具有確切的抗炎作用[1]，目前主要用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[2]，近年來其在其他疾病中的治療作用也逐漸受到關(guān)注，但是在眼科方面還未見應(yīng)用報道。雙醋瑞因是一種小分子化合物，具有較好的角膜穿透性及較高的角膜濃度[3]，該藥可能具有減輕角膜炎癥的作用。角膜堿燒傷是臨床常見的眼外傷，其所造成的無菌性炎癥，除了化學(xué)物質(zhì)的直接作用外，炎癥反應(yīng)貫穿整個角膜堿燒傷病理過程[4]，是一種很好的角膜炎癥模型。因此，本文主要探討雙醋瑞因滴眼液對小鼠角膜堿燒傷的抗炎作用及其初步的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠174只，鼠齡8～12周，體質(zhì)量23～28 g，購自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，小鼠的飼養(yǎng)與使用均遵照視覺與眼科研究協(xié)會制定的科研動物使用規(guī)范，經(jīng)河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室管理及倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1實驗試劑NaOH(1310-73-2，美國Sigma公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(H19983005，新鄉(xiāng)華青藥業(yè)公司)；雙醋瑞因滴眼液(河南省眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室制備，科研專用)；FITC/Gr-1(11-5931-85，eBioscience)；PE/F480 (12-4801-82，eBioscience)；熒光素鈉(H11619-1009，美國Alcon公司)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定試劑盒(A044，南京建成生物工程研究所)。

1.2.2主要儀器手術(shù)顯微鏡(YZ20T4，蘇州六六視覺科技股份有限公司)；裂隙燈顯微鏡(SLM-8E，中國康華瑞明)；角膜剪及顯微鑷(蘇州明仁醫(yī)療器械廠)；全自動數(shù)字切片掃描儀(Pannoramic 250/MIDI，匈牙利3 D HISTECH)；離心機(jī)(D1008E，美國Scilogex公司)；分光光度計(UV-1601，日本Shimadzu公司)。

1.3方法

1.3.1角膜堿燒傷模型的建立經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查角膜無異常的小鼠174只，參考文獻(xiàn)[5]制作角膜堿燒傷模型，具體如下：按照80 mg·kg-1的劑量腹腔內(nèi)注射10 g·L-1戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉，用 4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行角膜表面麻醉，以直徑2 mm的圓形濾紙片浸入0.3 mol·L-1NaOH溶液中60 s，在干燥濾紙上吸除多余的堿液，立即均勻地貼于小鼠角膜中央60 s，取下濾紙后用20 mL生理鹽水迅速沖洗1 min，制作小鼠角膜堿燒傷模型。

1.3.2分組及給藥方式造模后使用裂隙燈顯微鏡觀察小鼠角膜，1.5 d后依據(jù)角膜臨床評分采用隨機(jī)數(shù)字分組法將小鼠角膜堿燒傷模型分為雙醋瑞因組、地塞米松組和生理鹽水組，每組各58只。隨后分別給藥干預(yù)，雙醋瑞因組每2 h給予雙醋瑞因滴眼液滴眼1次，共6次，間隔12 h后重復(fù)進(jìn)行，直至實驗結(jié)束；地塞米松組每4 h給予地塞米松滴眼液滴眼1次，共3次，間隔12 h后重復(fù)進(jìn)行，直至實驗結(jié)束；生理鹽水組給予生理鹽水滴眼，給藥方法同雙醋瑞因組。為保證用藥效果，每次給藥后保持眼裂睜開約30 s，確保藥物進(jìn)入結(jié)膜囊。

1.3.3模型觀察各組隨機(jī)選取16只小鼠于造模成功后2 d(用藥后0.5 d)、3 d(用藥后1.5 d)、4 d(用藥后2.5 d)、5 d(用藥后3.5 d)在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜，進(jìn)行角膜混濁度以及病灶面積的臨床評分，并使用裂隙燈顯微鏡對小鼠眼部進(jìn)行拍照，臨床具體評分規(guī)則參照文獻(xiàn)。角膜混濁度[6]：1分為角膜輕度霧狀混濁，瞳孔、虹膜清晰可見；2分為角膜淺層混濁，透過病灶可見瞳孔及虹膜；3分為角膜全層呈不均勻混濁，瞳孔及虹膜幾乎不可見；4分為角膜均勻致密混濁，瞳孔及虹膜不可窺見。病灶面積[7]：1分為占角膜總面積1%～25%；2分為占角膜總面積>25%～50%；3分為占角膜總面積>50%～75%；4分為占角膜總面積>75%～100%。

1.3.4角膜上皮缺損面積的定量各組隨機(jī)選取16只小鼠于造模后2 d、3 d、4 d、5 d分別用10 g·L-1熒光素鈉行角膜染色，生理鹽水沖洗，裂隙燈鈷藍(lán)光拍照，圖像處理軟件Photoshop CS6(13.0.1)定量各組小鼠角膜上皮缺損面積。

1.3.5角膜平鋪片中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞染色及定量各組分別在造模后2 d、3 d、5 d各隨機(jī)處死6只小鼠并取角膜，用40 g·L-1多聚甲醛固定液室溫固定，修剪角膜保留角膜緣及完整的角膜組織，2 g·L-1Triton-BSA溶液室溫破膜封閉，加入已配制抗體FITC/Gr-1或PE/F480，避光放置于4 ℃冰箱過夜，第2天進(jìn)行角膜平鋪片。用全自動數(shù)字切片掃描儀全景掃描熒光染色角膜整個鋪片，對樣品進(jìn)行逐層掃描，各個層面進(jìn)行3 D合成，用計算機(jī)圖像分析軟件Caseviewer(2.0)和Photoshop CS6(13.0.1)計量全角膜圖像中特異性標(biāo)記的熒光面積，也就是角膜中的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的面積。

1.3.6MPO活性測定每組分別在造模后2 d、3 d、5 d各隨機(jī)處死8只小鼠，將各組小鼠角膜組織進(jìn)行研磨，制備成組織漿液，離心后取上清，然后根據(jù)MPO試劑盒提示依次加入樣本、各種試劑和顯色液，最后將以上混合物置入1 cm直徑比色皿中，在分光光度計460 nm波長下進(jìn)行比色測定MPO活性。

2 結(jié)果

2.1雙醋瑞因?qū)π∈蠼悄A燒傷臨床評分的影響堿燒傷造模后2 d，各組小鼠角膜中央均出現(xiàn)混濁，其混濁度為透過病灶可窺見瞳孔及虹膜。造模后3 d，生理鹽水組角膜混濁進(jìn)一步加重，病灶區(qū)瞳孔和虹膜紋理幾乎不可見，雙醋瑞因組和地塞米松組可窺見瞳孔。模型制作后前3 d各組小鼠角膜混濁度及病灶面積均逐漸增加，3 d時生理鹽水組病灶面積最大，4 d時角膜病灶區(qū)呈灰白色，混濁度評分最高，之后混濁度及病灶面積均逐漸下降。地塞米松組及雙醋瑞因組造模后3 d時臨床評分最高，4 d時病灶面積及混濁度均下降，雙醋瑞因組較地塞米松組下降明顯，角膜病灶區(qū)呈云翳樣改變。造模后5 d各組小鼠角膜臨床評分均下降，生理鹽水組角膜變化不明顯，雙醋瑞因組角膜臨床評分下降顯著，病灶區(qū)呈薄霧樣，地塞米松組次之。雙醋瑞因組及地塞米松組造模后4 d、5 d角膜臨床評分較生理鹽水組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)；雙醋瑞因組角膜臨床評分與地塞米松組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖1和表1。

圖1 堿燒傷模型造模后不同時間點各組小鼠角膜透明度及病灶面積表現(xiàn)

表1 堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜臨床評分比較

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2雙醋瑞因?qū)π∈蠼悄A燒傷上皮愈合的影響造模后2 d雙醋瑞因組小鼠角膜上皮愈合過半，3 d上皮缺損進(jìn)一步減少，5 d小鼠角膜上皮基本愈合。造模后3 d，地塞米松組角膜上皮愈合約半，4 d缺損減少呈點片狀，5 d上皮仍有部分缺損。生理鹽水組造模后3 d角膜上皮缺損仍有過半，4 d角膜上皮愈合近半，5 d角膜上皮缺損面積較雙醋瑞因組及地塞米松組大。角膜堿燒傷后各組小鼠角膜上皮愈合速率存在差異，造模后2 d、3 d、4 d、5 d雙醋瑞因組較生理鹽水組角膜上皮愈合較快，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；地塞米松組角膜上皮愈合較生理鹽水組變化不明顯。見圖2和表2。

圖2 堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜上皮缺損情況

表2 堿燒傷后不同時間點各組小鼠角膜裂隙燈下上皮缺損面積比較(n=16)

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01；與地塞米松組相比，#P<0.01

2.3雙醋瑞因?qū)π∈髩A燒傷角膜炎癥細(xì)胞的影響

2.3.1雙醋瑞因?qū)π∈髩A燒傷角膜中性粒細(xì)胞的影響造模后2 d各組小鼠中性粒細(xì)胞主要集中在角膜緣部位，生理鹽水組角膜中性粒細(xì)胞數(shù)量較多，角膜緣綠色熒光條帶明顯較寬，地塞米松組次之，雙醋瑞因組角膜緣綠色熒光條帶較窄；造模后3 d中性粒細(xì)胞進(jìn)一步向角膜旁中央及損傷區(qū)趨化，各組角膜緣血管旁中性粒細(xì)胞浸潤均明顯減少，生理鹽水組較其他兩組綠色熒光面積較大，雙醋瑞因組及地塞米松組角膜旁中央及病灶區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少；造模后5 d各組小鼠中性粒細(xì)胞浸潤進(jìn)一步減少，雙醋瑞因組角膜緣血管旁中性粒細(xì)胞消退明顯，旁中央及損傷區(qū)綠色熒光面積較生理鹽水組減小，呈點狀散在分布，地塞米松組次之。3組小鼠角膜中性粒細(xì)胞定量結(jié)果見表3，雙醋瑞因組角膜中性粒細(xì)胞造模后2 d、3 d、5 d均較生理鹽水組浸潤少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)；各時間點地塞米松組角膜中性粒細(xì)胞浸潤少于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3和表3。

2.3.2雙醋瑞因?qū)π∈髩A燒傷角膜巨噬細(xì)胞的影響造模后2 d各組小鼠從角膜緣至角膜中央均可見少量巨噬細(xì)胞浸潤，但巨噬細(xì)胞大多呈單個散在分布，且生理鹽水組較雙醋瑞因組及地塞米松組巨噬細(xì)胞分布密度高、紅色熒光面積大；造模后3 d小鼠角膜緣和旁中央巨噬細(xì)胞遷入，雙醋瑞因組及地塞米松組巨噬細(xì)胞增加相對較少，生理鹽水組角膜緣紅色熒光條帶明顯增寬，且角膜紅色熒光面積較雙醋瑞因組大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；造模后5 d角膜緣和旁中央大量巨噬細(xì)胞涌入，遷移至角膜中央，生理鹽水組角膜旁中央及病灶區(qū)大片巨噬細(xì)胞浸潤，雙醋瑞因組及地塞米松組較生理鹽水組增加少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4和圖4。

圖3 堿燒傷不同時間點各組小鼠角膜的中性粒細(xì)胞浸潤情況。綠色為抗體FITC/Gr-1標(biāo)記中性粒細(xì)胞

表3 堿燒傷不同時間點各組小鼠角膜中性粒細(xì)胞的定量(n=6)

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01；與地塞米松組相比，#P<0.01

表4 堿燒傷不同時間點各組小鼠角膜巨噬細(xì)胞的定量(n=6)

注：與生理鹽水組相比，*P<0.05，**P<0.01；與地塞米松組相比，#P<0.01

2.4雙醋瑞因?qū)π∈髩A燒傷角膜MPO的影響對各組小鼠不同時間點角膜MPO活性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組在各個時間點MPO活性均較高，雙醋瑞因組及地塞米松組角膜MPO活性造模后2 d、3 d、5 d均較生理鹽水組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。見表5。

圖4 堿燒傷不同時間點各組小鼠角膜巨噬細(xì)胞浸潤情況。紅色為抗體PE/F480標(biāo)記巨噬細(xì)胞

表5 堿燒傷不同時間點各組小鼠角膜MPO活性定量(n=8)

注：與生理鹽水組相比，*P<0.01；與地塞米松組相比，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

雙醋瑞因是一種蒽醌衍生物，活性代謝產(chǎn)物為大黃酸，目前主要用于骨關(guān)節(jié)炎的治療，通過抑制軟骨基質(zhì)的降解來緩解骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛和改善關(guān)節(jié)功能。雙醋瑞因的主要作用機(jī)制是減少IL-1轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生來抑制IL-1β的激活和相關(guān)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，此外還可以減少基質(zhì)金屬蛋白酶、一氧化氮、IL-6等的產(chǎn)生[8]。因此，雙醋瑞因具有顯著的抗炎作用。而本研究將雙醋瑞因配制成符合眼部藥理要求的雙醋瑞因滴眼制劑，通過小鼠角膜堿燒傷模型來研究其抗炎作用。

角膜堿燒傷是一種常見的化學(xué)性眼外傷，以持續(xù)性角膜上皮缺損及角膜潰瘍?yōu)樘卣鳎悄A損傷后會引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，雖然角膜損傷的愈合需要一定程度的炎癥，但是炎癥細(xì)胞的持續(xù)存在會延遲角膜上皮再生，導(dǎo)致角膜基質(zhì)層損傷并形成潰瘍，最終留下不同程度的角膜混濁[9]。本研究結(jié)果表明，雙醋瑞因可以降低角膜堿燒傷混濁度，縮小角膜堿燒傷病灶面積，促進(jìn)角膜上皮的修復(fù)及減少角膜堿燒傷炎癥細(xì)胞的浸潤。還有研究表明[10]，角膜堿燒傷后受損的上皮及基質(zhì)分泌促炎細(xì)胞因子，刺激角膜基質(zhì)細(xì)胞釋放Fas配體，誘導(dǎo)附近角膜細(xì)胞凋亡，隨后角膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞活化，這些細(xì)胞一起恢復(fù)受損的角膜基質(zhì)及上皮，而過度的炎癥會增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞的活性，增強(qiáng)其纖維組織的沉積，隨之發(fā)生角膜基質(zhì)重塑，導(dǎo)致角膜混濁。因此，雙醋瑞因可能減少相關(guān)炎癥因子，降低肌成纖維細(xì)胞的活性，從而降低角膜混濁度及縮小病灶面積，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

此外，角膜上皮被認(rèn)為是識別病原體相關(guān)分子模式的第一道防御線，可以引發(fā)強(qiáng)烈的先天性免疫反應(yīng)，上皮的愈合取決于上皮細(xì)胞的遷移和增殖，以及上皮基底膜的完整性[11]，并且受各種細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞等的影響。在本研究中，局部應(yīng)用雙醋瑞因滴眼制劑可提高角膜上皮修復(fù)速度，我們猜測可能與雙醋瑞因抑制炎癥反應(yīng)及促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。Toegel等[12]利用體外實驗證明雙醋瑞因可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，從而增加軟骨細(xì)胞的增殖能力，且該過程與炎癥因子IL-1β密切相關(guān)，該結(jié)論支持我們的猜想。

角膜堿燒傷時堿性物質(zhì)與角膜接觸造成組織的變性壞死，同時啟動免疫炎癥反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)[13]，前炎癥因子IL-1在角膜堿燒傷炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，角膜遭受化學(xué)性物質(zhì)損傷的早期，釋放大量IL-1，發(fā)出趨化信號吸引中性粒細(xì)胞，其分泌相關(guān)調(diào)節(jié)因子及清除壞死物質(zhì)，其后續(xù)效應(yīng)可造成角膜潰瘍。本研究得知，角膜堿燒傷后中性粒細(xì)胞開始向病變區(qū)游走，中性粒細(xì)胞首先自血管較為豐富的角膜緣向中央病變區(qū)定向聚集及浸潤。本研究結(jié)果表明，雙醋瑞因可以減少小鼠角膜緣及中央病變區(qū)中性粒細(xì)胞的浸潤，其作用機(jī)制可能與IL-1有關(guān)。根據(jù)國外學(xué)者[14-15]研究證明，NLRP3-ASC-caspase-1-IL-1β炎癥通路參與角膜堿燒傷炎癥反應(yīng)，在角膜堿燒傷后阻止該途徑可以抑制其炎癥反應(yīng)，該結(jié)論與本研究預(yù)想結(jié)果一致。

MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著中性粒細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)。該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點可以分析酶的活力，通過供氫體鄰聯(lián)茴香胺供氫后生成黃色化合物，在分光光度計460 nm處通過比色測定產(chǎn)物的生成量從而推算出MPO的活力和中性粒細(xì)胞的數(shù)目[16]。從研究結(jié)果來看，雙醋瑞因組及地塞米松組小鼠MPO活性較生理鹽水組低，且各組造模后2 d MPO活性最高，與本實驗中性粒細(xì)胞的定量結(jié)果一致，但MPO活性于造模后5 d呈上升趨勢，與本實驗中性粒細(xì)胞定量隨時間逐漸下降呈相反趨勢。經(jīng)進(jìn)一步驗證及相關(guān)文獻(xiàn)得知，角膜堿燒傷后巨噬細(xì)胞于第1天開始增加，7～10 d達(dá)高峰，且與角膜新生血管形成密切相關(guān)，是角膜堿燒傷炎癥反應(yīng)的后期階段[17]。而中性粒細(xì)胞是MPO含量最豐富的細(xì)胞，但MPO亦存在于巨噬細(xì)胞[18]，并有相關(guān)研究將其用于巨噬細(xì)胞活性測定[19]。故本研究又進(jìn)一步對各組不同時間點巨噬細(xì)胞進(jìn)行定量，該結(jié)果又進(jìn)一步證實小鼠角膜堿燒傷MPO活性于造模后5 d因巨噬細(xì)胞增加呈上升趨勢，且雙醋瑞因組及地塞米松組較生理鹽水組增加較慢，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，雙醋瑞因作為一種IL-1抑制劑，可以減少小鼠角膜堿燒傷炎癥細(xì)胞的浸潤，改善角膜堿燒傷預(yù)后。