程 輝，梁 奕，俞圣韜，葉仲杜，蔣 晗，朱 誠，*

(1.浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018； 2.中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科的一類革蘭氏陰性菌，它是全球最重要的食源性致病菌之一，且被世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization， WHO)列為具有中等乃至嚴(yán)重危害的食源性病原菌[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，越來越多的沙門氏菌在致病的同時(shí)，具有多重耐藥性[2-4]，其攜帶的耐藥基因可以通過水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transmission， HGT)等方式遷移擴(kuò)散[5]，嚴(yán)重危害人類健康，其中整合酶基因(integrase gene，intI)尤其是1類整合酶基因(intI1)在此擴(kuò)散中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、高效且可同時(shí)檢測沙門氏菌及其耐藥相關(guān)整合酶基因的方法，對于食品安全保障和細(xì)菌耐藥性防控具有重要意義。

針對沙門氏菌和intI1基因，研究人員已開展了常規(guī)PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)等研究[7-10]，其中PCR方法雖靈敏度高，但檢測效率較低；LAMP方法雖用時(shí)短且擺脫了對儀器的依賴，但假陽性高，極易污染[11]。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種在常溫下可以使核酸快速擴(kuò)增的方法。在25～42 ℃等溫條件下，重組酶uvsX與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下，使模板DNA解鏈，并在鏈置換DNA聚合酶Bsu的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩條引物起始一個(gè)合成事件，整個(gè)過程進(jìn)行得非?？?，一般在30 min內(nèi)即能獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物[12-16]。本文所采用的熒光定量重組酶聚合酶擴(kuò)增(duplex real-time RPA， RT-RPA)方法，可在常溫下高速擴(kuò)增沙門氏菌的特異基因fimY和1類耐藥相關(guān)整合酶基因intI1，其關(guān)鍵技術(shù)在于exo探針的設(shè)計(jì)，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快(檢測時(shí)間20 min)，在實(shí)際樣品檢測試驗(yàn)中準(zhǔn)確率高。這對沙門氏菌及其耐藥性相關(guān)整合子基因的快速檢測、早期預(yù)警、切斷傳播途徑從而保障人類安全健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌株

腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisGIMCC1.345、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusGIMCC1.142、阪崎腸桿菌CronobacterSakazakiiGIMCC1.296、志賀氏菌Shigellaspp. GIMCC1.424均購自廣東省微生物菌種保藏中心。β溶血性鏈球菌StreptococcushemolyticusATCC21059、副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802、單增李斯特菌ListeriamonocytogenesATCC19115均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。實(shí)際樣品檢測試驗(yàn)中，2株攜帶intI1基因的沙門氏菌，555株攜帶intI1基因的大腸埃希菌從生豬養(yǎng)殖場、屠宰場、超市和農(nóng)貿(mào)市場篩選得到[17]。所有微生物實(shí)驗(yàn)均在Ⅱ級生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司。分子相關(guān)試劑均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。其他化學(xué)試劑均購自Sigma。

1.2 儀器與設(shè)備

美國Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR儀、美國Thermal離心機(jī)、美國Bio-Rad PCR儀、美國Bio-Rad電泳儀、美國Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.3 引物與探針

根據(jù)大腸埃希菌uidA基因(GenBank登錄號：S69414)，沙門氏菌fimY基因(GenBank登錄號：JQ665438)、intI1基因(GenBank登錄號：HM569736)，設(shè)計(jì)PCR引物、熒光定量PCR引物、RPA引物和exo探針(表1)，exo探針中間標(biāo)記熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，插入四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)基團(tuán)(圖1)。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組提取

在-80 ℃ 冰箱中取出實(shí)驗(yàn)室凍存的沙門氏菌菌種進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，隨后劃線接種于亞硫酸鉍培養(yǎng)基，于37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于亞硫酸鉍培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至菌液D600值為1.0。其余菌株在各自最適條件下培養(yǎng)。需檢測的革蘭氏陰性菌菌液采用煮沸法制備菌液模板DNA。取1 μL待測菌液加入30 μL Tris緩沖液，煮沸5 min，冰上冷卻2 min，12 000×g離心2 min，取上清液用作DNA模板。革蘭氏陽性菌模板DNA采用試劑盒法，操作按試劑盒操作說明進(jìn)行。

表1引物和探針序列

Table1Sequences of primers and exo probes

圖1 RPA exo探針設(shè)計(jì)圖Fig.1 Exo probe of RPA

1.5 濃度梯度樣品稀釋

取D600為1.0的腸炎沙門氏菌培養(yǎng)液、實(shí)驗(yàn)室篩選到的攜帶intI1的大腸埃希菌培養(yǎng)液各1 mL，按照10倍梯度進(jìn)行稀釋并進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，每組濃度3個(gè)平行，取平均值計(jì)算原液中的細(xì)菌濃度。將經(jīng)活菌計(jì)數(shù)的腸炎沙門氏菌培養(yǎng)液、攜帶intI1基因的大腸埃希菌培養(yǎng)液，分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別提取DNA，獲得腸炎沙門氏菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌的系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品(108～100CFU·mL-1)。

1.6 RPA方法的建立與優(yōu)化

50 μL RPA反應(yīng)體系包含2× RE緩沖液25 μL，250 mmol·L-1醋酸鎂溶液2.5 μL，2 μL的primerF和primerR，1 μL的exo探針和2 μL的DNA模板和2 μL酶工作液。反應(yīng)程序?yàn)?7 ℃ 反應(yīng)20 min (30 s一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)收集1次熒光)，反應(yīng)過程借助熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測。為獲得較優(yōu)的結(jié)果，對雙重RT-RPA的引物和探針濃度、反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，反應(yīng)溫度從30 ℃到41 ℃進(jìn)行梯度優(yōu)化，引物和探針濃度按表2所示濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 特異性實(shí)驗(yàn)

使用雙蒸水作為陰性對照，分別使用沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、β溶血性鏈球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌、大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21、攜帶intI1基因的沙門氏菌等11種菌種基因組DNA作為模板，反應(yīng)體系采用前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的RPA體系，進(jìn)行RT-RPA特異性驗(yàn)證。

1.8 靈敏度實(shí)驗(yàn)

以1.5節(jié)制備的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在最佳條件下進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，以檢驗(yàn)反應(yīng)靈敏度，并與常規(guī)RT-PCR靈敏度進(jìn)行比較分析。

1.9 雙重RT-RPA方法在實(shí)際菌株鑒定中的應(yīng)用

參照GB 4789.38—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》、GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》中的方法，從養(yǎng)豬場、屠宰場、農(nóng)貿(mào)市場和超市環(huán)境樣品與豬肉樣品分離耐藥性大腸埃希菌和沙門氏菌，并參照Zhu等[18]的方法對intI1基因進(jìn)行鑒定。對比選擇性平板培養(yǎng)、FDA推薦的微生物分析法[19]、PCR擴(kuò)增和RT-RPA擴(kuò)增等方法進(jìn)行菌株結(jié)果鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA檢測方法的建立與雙重RT-RPA的優(yōu)化

分別以陽性沙門氏菌基因組DNA和攜帶intI1基因的耐藥大腸埃希菌為模板，篩選RT-RPA引物探針組合、優(yōu)化單重RT-RPA的反應(yīng)溫度、探針濃度，建立最優(yōu)的單重RT-RPA反應(yīng)體系。結(jié)果顯示：沙門氏菌RT-RPA引物探針組合1優(yōu)于組合2，intI1引物探針組合1優(yōu)于組合2(圖2-A)，選擇引物探針組合1進(jìn)行后續(xù)的RT-RPA實(shí)驗(yàn)。

設(shè)置30～41 ℃的溫度梯度 (30.0 ℃、30.7 ℃、32.1 ℃、34.3 ℃、36.9 ℃、39.1 ℃、40.3 ℃、41 ℃)，優(yōu)化RT-RPA反應(yīng)溫度，結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為36.9 ℃時(shí)，兩組RT-RPA反應(yīng)均有較好的擴(kuò)增(圖2-B和圖2-C)。優(yōu)化exo探針濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，fimY探針濃度為60 nmol·L-1時(shí)，檢測fimY效率較高，intI1探針濃度為100 nmol·L-1時(shí)，檢測intI1效率較高。在單重RT-RPA優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行雙重RT-RPA引物和探針濃度優(yōu)化，結(jié)果顯示，當(dāng)fimY引物終濃度為320 nmol·L-1，intI1引物400 nmol·L-1，fimY探針終濃度為60 nmol·L-1，intI1探針終濃度為100 nmol·L-1時(shí)，fimY和intI1同步檢測效果最優(yōu)(表2)。

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

按照1.7節(jié)特異性實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行檢測，如圖3-A所示，經(jīng)過雙重RT-RPA檢測，在添加有沙門氏菌、攜帶intI1基因的沙門氏菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌樣品中均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，且攜帶intI1基因的沙門氏菌出現(xiàn)2條擴(kuò)增曲線，顯示為陽性。添加其他干擾菌的樣品均無明顯擴(kuò)增，結(jié)果為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究建立的多重?zé)晒舛繖z測方法對沙門氏菌及其耐藥相關(guān)intI1基因有較好的特異性，與其他相關(guān)細(xì)菌無交叉反應(yīng)。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

按照1.8節(jié)靈敏度實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行檢測，對濃度為1.29×105、1.29×104、1.29×103、1.29×102、1.29×101、1.29×100CFU·mL-1的沙門氏菌進(jìn)行RT-RPA和熒光定量PCR檢測，對濃度為1.60×105、1.60×104、1.60×103、1.60×102、1.60×101、1.60×100CFU·mL-1的intI1基因進(jìn)行RT-RPA和熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，RT-RPA方法對沙門氏菌檢測下限為1.29×101CFU·mL-1，對intI1基因檢測下限為1.60×101CFU·mL-1(圖3-B和圖3-C)，與常規(guī)RT-PCR的檢測靈敏度一致(圖3-D和圖3-E)。

2.4 實(shí)驗(yàn)樣品的檢測

A: 1，fimY引物探針組合1；2，intI1引物探針組合1；3，fimY引物探針組合2；4，intI1引物探針組合2。B、C: 1，溫度36.9 ℃。A: 1， The first combination of fimY primer and probe; 2， The first combination of intI1 primer and probe; 3， The second combination of fimY primer and probe; 4， The second combination of intI1 primer and probe. B and C: 1, The temperature is 36.9 ℃.圖2 RT-RPA反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of reaction for RT-RPA

表2雙重RT-RPA引物與探針濃度優(yōu)化

Table2Optimization of primers and probes concentration for duplex RT-RPA

組合Group引物濃度Concentration of primers/(nmol·L-1)fimYintI1探針濃度Concentration of probes/(nmol·L-1)fimYintI1Ct值Ct valuefimYintI1140040012012019.48—24004006010019.9721.5033204006010018.1219.4843203206010022.3124.6452403206010023.0425.816240240608025.2827.157160240608028.6128.008160160406030.2230.73980160404035.05—

如表3所示，雙重RT-RPA方法對在豬肉生產(chǎn)鏈中篩選到的沙門氏菌、大腸埃希菌及其攜帶intI1基因的檢測結(jié)果與FDA推薦的微生物分析法[18]、PCR法檢測結(jié)果一致，但雙重RT-RPA方法的檢出時(shí)間較微生物分析法、PCR法有明顯縮短。微生物分析法需過夜培養(yǎng)，PCR法鑒定需要2 h以上，RT-RPA可以在20 min完成檢測。此外，RT-RPA結(jié)果直接通過擴(kuò)增曲線判定，不需要開蓋電泳，故與PCR產(chǎn)物電泳鑒定方法相比，降低了擴(kuò)增產(chǎn)物對環(huán)境的污染，這對降低因環(huán)境污染導(dǎo)致的假陽性率大有裨益。

3 結(jié)論

本研究以RPA方法為技術(shù)基礎(chǔ)，建立了一種能單管同時(shí)快速鑒定沙門氏菌及其耐藥相關(guān)intI1基因的雙重RT-RPA方法。該方法以沙門氏菌特異毒力基因fimY和細(xì)菌耐藥相關(guān)1類整合酶基因intI1為靶標(biāo)序列，建立了基于exo探針的雙重RT-RPA方法，當(dāng)fimY引物終濃度320 nmol·L-1，intI1引物終濃度400 nmol·L-1，fimY探針終濃度60 nmol·L-1，intI1探針終濃度100 nmol·L-1，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)20 min 時(shí)，雙重RT-RPA擴(kuò)增效率最高，且特異性好，靈敏度高。實(shí)際應(yīng)用中，該方法檢測準(zhǔn)確率高。

A: 1-1，攜帶intI1基因的沙門氏菌fimY基因擴(kuò)增曲線；1-2，攜帶intI1基因的沙門氏菌intI1基因擴(kuò)增曲線；2，沙門氏菌；3，攜帶intI1基因的大腸埃希菌；4-11，副溶血弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、β溶血性鏈球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21；12,陰性對照。B: 1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 v·mL-1。 C: 1，1.60×105 CFU·mL-1；2，1.60×104 CFU·mL-1；3，1.60×103 CFU·mL-1；4，1.60×102 CFU·mL-1；5，1.60×101 CFU·mL-1；6，1.60×100 CFU·mL-1。D: fimY基因常規(guī)RT-PCR靈敏度試驗(yàn)，1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 CFU·mL-1。E: intI1基因常規(guī)RT-PCR靈敏度試驗(yàn)，1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 CFU·mL-1。A: 1， Amplification of fimY(intI1-positive salmonella); 1-2， Amplification of intI1 (intI1-positive salmonella); 2， Salmonella; 3， IntI1-positive E.coli; 4-11， Vibrio parahaemolyticus， Shigella， Staphylococcus aureus， β-hemolytic streptococcus， Listeria monocytogenes， Enterobacter sakazakii， E. coli DH5α， E. coli BL21; 12, Negative sample. B: 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2， 1.29×104 CFU·mL-1; 3， 1.29×103 CFU·mL-1; 4， 1.29×102 CFU·mL-1; 5， 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1. C: 1， 1.60×105 CFU·mL-1; 2， 1.60×104 CFU·mL-1; 3， 1.60×103 CFU·mL-1; 4， 1.60×102 CFU·mL-1; 5， 1.60×101 CFU·mL-1; 6， 1.60×100 CFU·mL-1. D: Sensitivity of RT-PCR for fimY， 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2, 1.29×104 CFU·mL-1; 3, 1.29×103 CFU·mL-1; 4, 1.29×102 CFU·mL-1; 5, 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1. E: Sensitivity of RT-PCR for intI1， 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2， 1.29×104 CFU·mL-1; 3， 1.29×103 CFU·mL-1; 4， 1.29×102 CFU·mL-1; 5， 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1.圖3 RT-RPA特異性與常規(guī)RT-PCR靈敏度Fig.3 Specificity and sensitivity of RT-RPA and RT-PCR

A: uidA基因、fimY基因、intI1基因PCR電泳結(jié)果，M為DL 2 000 marker；1為攜帶有intI1基因的沙門氏菌；2為不攜帶intI1基因的沙門氏菌；3為攜帶有intI1基因的大腸埃希菌；4為陰性對照。B：大腸埃希菌和沙門氏菌選擇性培養(yǎng)結(jié)果，大腸埃希菌在伊紅美藍(lán)選擇性平板上為綠色金屬光澤菌落，沙門氏菌在亞硫酸鉍選擇性平板上為灰色金屬光澤菌落。C: RT-RPA鑒定結(jié)果，1為攜帶有intI1基因的沙門氏菌；2為不攜帶intI1基因的沙門氏菌；3為攜帶有intI1基因的大腸埃希菌；4為陰性對照。A: uidA， fimY and intI1 of PCR， M represented DL 2 000 marker; Lane 1 represented intI1-positive Salmonella; Lane 2 represented intI1-negative Salmonella; Lane 3 represented intI1-positive E.coli; Lane 4 represented negative control. B: Selective plate for E. coli and Salmonella， E. coli was green metallic luster colony on the EMB plate， and Salmonella was gray metallic luster colony on the BS plate. C: Lane 1 represented intI1-positive Salmonella; Lane 2 represented intI1-negative Salmonella; Lane 3 represented intI1-positive E.coli; Lane 4 represented negative control.圖4 不同方法在菌株和intI1基因鑒定中的應(yīng)用Fig.4 Application of different methods in identification of strains and intI1 gene

表3RT-RPA方法在菌株及intI1基因鑒定中的應(yīng)用

Table3Application of RT-RPA method in identification of strains andintI1 gene

目標(biāo)菌株Target isolates鑒定結(jié)果Identification results/strain選擇性培養(yǎng)法Selective culturePCRRT-RPA細(xì)菌培養(yǎng)法Bacterium culture大腸埃希菌Escherichia coli14601038—1038沙門氏菌Salmonella168616161攜帶intI1大腸埃希菌intI1-positive Escherichia coli—555555—攜帶intI1沙門氏菌intI1-positive Salmonella—22—

本研究將RT-RPA方法應(yīng)用到耐藥性相關(guān)1類整合酶基因的檢測，并實(shí)現(xiàn)了對沙門氏菌和1類整合酶基因的雙重同步檢測。該方法檢測時(shí)間只需20 min，較傳統(tǒng)的方法大大縮短。該方法的建立對沙門氏菌及其耐藥性相關(guān)整合子基因的快速檢測、早期預(yù)警、切斷傳播途徑進(jìn)而保障人們安全健康具有重要意義。也可為食品中其他致病微生物及其耐藥性的快速檢測研究提供借鑒，使食品中致病微生物及其耐藥性檢測向高通量、高靈敏、簡便經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。