郭丹丹，楊清華，朱丹華，金杭霞，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州310021)

干旱脅迫是影響植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫之一，具有重要的農(nóng)藝學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。氣候變化預(yù)測(cè)表明，未來(lái)干旱事件頻率將會(huì)上升[1-2]，因此，增強(qiáng)植物耐旱性使植物適應(yīng)干旱環(huán)境是提高作物產(chǎn)量行之有效的方法之一。植物適應(yīng)環(huán)境脅迫重要的途徑之一是滲透調(diào)節(jié)，脯氨酸(proline)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[3-4]，它在穩(wěn)定膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)[5]、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[5-6]和激活植物體內(nèi)多種反應(yīng)信號(hào)中有著重要作用[7]。

在高等植物中，脯氨酸主要是由谷氨酸通過(guò)2種酶作用合成：Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)[8]。合成過(guò)程中，P5CS是催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為δ1-吡咯啉-5-羧酸鹽(P5c)并還原成脯氨酸的關(guān)鍵酶。脯氨酸的重要功能在植物應(yīng)激防御中得到了廣泛的體現(xiàn)，目前已在木薯、蒙古冰草、苜蓿、煙草等植物中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，P5CS基因過(guò)表達(dá)使植物體內(nèi)脯氨酸含量上升，增強(qiáng)植物的應(yīng)急防御能力，提升了植物耐受性[9-12]。

堿蓬(Suaedasalsa)是一種鹽生植物，耐鹽堿、貧瘠，生長(zhǎng)于沿海地區(qū)。堿蓬對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，為研究鹽脅迫和抗旱相關(guān)基因提供了有價(jià)值的材料來(lái)源[13]。本研究從堿蓬中克隆出P5CS基因，命名為SgP5CS，將其轉(zhuǎn)入到擬南芥中，進(jìn)行表達(dá)模式分析和耐旱性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

堿蓬種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室，光周期16 h/8 h(L/D)，溫度25 °C，生長(zhǎng)1個(gè)月。用200 mmol·L-1甘露醇處理植株3 d，采集處理后的堿蓬和未經(jīng)處理的堿蓬(對(duì)照)葉片，立即冷凍并保存在液氮中以備提取RNA；將生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗分別用0 mmol·L-1(對(duì)照)和200 mmol·L-1甘露醇進(jìn)行干旱脅迫2周。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA合成和qPCR分析

以經(jīng)過(guò)干旱處理3 d的堿蓬葉片為材料，采用Trizol法[14]提取總RNA，-70 ℃保存。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查找已有的大豆、水稻等植物的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列，用Clustalw2多序列比對(duì)后，設(shè)計(jì)包含完整開(kāi)放閱讀框(ORF)的簡(jiǎn)并引物SgP5CS-F(5’-ATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGT-3’)和SgP5CS-R(5’-AGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAA-3’)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)合成cDNA第1條鏈。以cDNA為模板使用Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并回收目的條帶。使用Roche LightCycler? 480 II定量PCR儀對(duì)SgP5CS基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2SgP5CS基因表達(dá)載體構(gòu)建和擬南芥轉(zhuǎn)化

參照金杭霞等[15]的方法進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。將含SgP5CS的pEASY-Blunt質(zhì)粒和pCAMBIA1301-gfp空載體分別雙酶切(SacⅠ內(nèi)切酶+BamH Ⅰ內(nèi)切酶)。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，用DNA凝膠回收試劑盒回收大小約2 100 bp的目的條帶和大小約14 kb左右的pCAMBIA1301-gfp載體片段。T4-DNA連接酶將2個(gè)DNA回收片段在室溫條件下連接過(guò)夜。利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α中，涂布LB平板(含100 mg·L-1卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑單菌落搖菌、抽提質(zhì)粒，經(jīng)SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切驗(yàn)證后送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證后，命名為SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp。將SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，涂布LB平板(含50 mg·L-1利福平和100 mg·L-1卡那霉素)，28 ℃條件下培養(yǎng)形成菌落，挑單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證、抽提質(zhì)粒、雙酶切驗(yàn)證。

利用花序浸染法分別將含有重組質(zhì)粒SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp和pCAMBIA1301-gfp空載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在含有50 mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選，選取抗性苗移植，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因苗溫室培養(yǎng)后收獲T1代種子。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定

在含50 mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選出SgP5CS過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，在16 h/8h(L/D)光暗周期，25 °C室內(nèi)培養(yǎng)。提取篩選到的擬南芥抗性苗總RNA，以此為qRT-PCR模板，利用SgP5CS150-F(5’-TGGACCTGACCTCTGC-3’)和SgP5CS150-R(5’-CTTTCCTGGTACTTACTGC-3’)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性和生理指標(biāo)的測(cè)定

將T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和對(duì)照組(轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-gfp空質(zhì)粒擬南芥植株)種子表面滅菌，播種于含50 mg·L-1潮霉素的固體MS培養(yǎng)基上。7 d后，選擇具有同等生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，分別移植到含0和200 mmol·L-1甘露醇的固體MS培養(yǎng)基上，2周后每個(gè)株系分別測(cè)定30株擬南芥的根長(zhǎng)，并觀察植株整體生長(zhǎng)狀態(tài)。脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮顯色法[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定使用硫代巴比妥酸法[17-18]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin Pro 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下SgP5CS基因在堿蓬中的表達(dá)分析

為了探究SgP5CS是否受到非生物脅迫的誘導(dǎo)，對(duì)堿蓬幼苗進(jìn)行了3 d干旱脅迫(200 mmol·L-1甘露醇)。通過(guò)qRT-PCR方法測(cè)定基因表達(dá)量，結(jié)果如圖1所示。SgP5CS基因在干旱脅迫條件下表達(dá)水平是對(duì)照的43.7倍，具有極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明干旱脅迫可顯著誘導(dǎo)SgP5CS的表達(dá)。

2.2 SgP5CS基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

將含SgP5CS的pEASY-Blunt質(zhì)粒和pCAMBIA1301-gfp空載體分別雙酶切，回收片段再連接，最終使SgP5CS的ORF插入到pCAMBIA1301-gfp載體的組成型表達(dá)啟動(dòng)子35S之后。構(gòu)建的重組表達(dá)載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ、BamH Ⅰ雙酶切后，得到2個(gè)不同大小的DNA片段，其中SgP5CS基因片段約2 100 bp(圖2)。對(duì)酶切的載體再次測(cè)序驗(yàn)證，顯示插入的片段序列與第1次測(cè)序結(jié)果相同，表明SgP5CS的ORF已經(jīng)插入到質(zhì)粒pCAMBIA1301-gfp中，說(shuō)明植物雙元表達(dá)載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp構(gòu)建成功。

**表示與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。下同。** indicated significant difference at 0.01 level compared with control group. The same as bellow.圖1 干旱脅迫誘導(dǎo)SgP5CS基因表達(dá)分析Fig.1 Analysis of SgP5CS gene expression induced by drought stress

2.3 SgP5CS基因轉(zhuǎn)擬南芥植株的獲得和篩選

利用花序侵染法將載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp和空載體轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)SgP5CS基因和轉(zhuǎn)空載體(CK)T0代擬南芥種子，在含有50 mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選10 d后，選取抗性苗移植。對(duì)4株已開(kāi)花的T1代擬南芥植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以轉(zhuǎn)空載體的擬南芥植株為陰性對(duì)照，在4株抗性苗中都擴(kuò)增出了約2 100 bp的DNA條帶，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(圖3)。

2.4 SgP5CS在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)

利用qRT-PCR方法對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，相同濃度干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥P1、P2和P3株系中均檢測(cè)到SgP5CS基因的表達(dá)且表達(dá)量顯著上調(diào)，尤其P3株系表達(dá)量極顯著高于對(duì)照(P<0.01)，而在轉(zhuǎn)空載體對(duì)照組中未檢測(cè)到SgP5CS基因(圖4)。

2.5 SgP5CS的過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性的影響

分別對(duì)SgP5CS過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系P1、P2、P3和轉(zhuǎn)空載體的對(duì)照植株進(jìn)行干旱(MS+200 mmol·L-1甘露醇)和正常條件(MS)處理。2周后，干旱脅迫下轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥株系

1，DNA marker；2，SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp酶切結(jié)果。1， DNA marker；2， Digestion results of SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp. 圖2 SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp

1，DNA marker；2～5，轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥植株；6，陰性對(duì)照。1， DNA marker; 2-5，Transgenic Arabidopsis plants with SgP5CS gene; 6， Negative control.圖3 SgP5CS轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS transgenic Arabidopsis

CK，轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株；P1～P3，轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥植株。下同。CK， Transgenic Arabidopsis line with empty plasmid; P1-P3， Transgenic Arabidopsis plants with SgP5CS gene. The same as bellow.圖4 干旱脅迫誘導(dǎo)擬南芥中SgP5CS基因表達(dá)分析Fig.4 Analysis of SgP5CS gene expression in Arabidopsis induced by drought stress

P1、P2和P3的根系長(zhǎng)度與對(duì)照相比均極顯著增加(圖5)，分別是對(duì)照的3.75、3.35和4.63倍。干旱脅迫下植株的根系長(zhǎng)度均低于正常條件下，其中，對(duì)照植株在干旱處理下根系長(zhǎng)度僅為正常條件下生長(zhǎng)的17.12%，P1、P2和P3植株分別為65.8%、59.52%和77.27%。同時(shí)，在未添加甘露醇的MS培養(yǎng)基上，由根系長(zhǎng)度可以看出，P1、P2、P3生長(zhǎng)狀況與對(duì)照相似(圖5、圖6-a)；而干旱條件下生長(zhǎng)狀況差異明顯，SgP5CS過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照，對(duì)照植株受脅迫影響明顯，表現(xiàn)出嚴(yán)重受損癥狀(圖6-b)。結(jié)果說(shuō)明SgP5CS過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性更強(qiáng)。

圖5 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥根長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of drought stress on root length of transgenic Arabidopsis with SgP5CS Gene

圖6 轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥和CK干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀況Fig.6 Effects of drought stress on the growth of transgenic Arabidopsis with SgP5CS gene and empty plasmid

2.6 丙二醛和游離脯氨酸含量變化

干旱脅迫(200 mmol·L-1甘露醇)2周后，SgP5CS基因過(guò)表達(dá)擬南芥株系P1、P2和P3中游離脯氨酸含量升高，與對(duì)照具有極顯著差異(P<0.01)，分別是對(duì)照植株的1.61、1.45和1.73倍；在正常條件下SgP5CS基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株的脯氨酸含量與對(duì)照植株無(wú)明顯差異，所有植株干旱脅迫后脯氨酸含量均高于正常條件下生長(zhǎng)的植株(圖7)。丙二醛含量是衡量植物對(duì)極端環(huán)境的耐受性指標(biāo)[19]，結(jié)果表明，干旱脅迫下丙二醛含量與對(duì)照相比極顯著下降(圖8)，分別下降了50.02%、54.35%和74.51%，尤其P3植株中含量?jī)H為對(duì)照的25.49%。結(jié)果顯示：生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照的轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)的脯氨酸水平較高，丙二醛含量較低，而表現(xiàn)出嚴(yán)重受損癥狀的對(duì)照植株相反，表明干旱脅迫下轉(zhuǎn)SgP5CS基因擬南芥與對(duì)照相比表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱能力。

圖7 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量影響Fig.7 Effects of drought stress on proline content in transgenic Arabidopsis

圖8 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥丙二醛含量影響Fig.8 Effects of drought stress on malondialdehyde content in transgenic Arabidopsis

3 討論

在高等植物中，脯氨酸在各種脅迫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，如應(yīng)對(duì)高鹽[20]、缺水[12]、極端溫度[21]和重金屬毒性[22]等。脯氨酸積累、P5CS基因過(guò)表達(dá)和對(duì)非生物脅迫的耐受性之間的關(guān)系已在許多實(shí)驗(yàn)中得到充分證明。P5CS基因受特異性調(diào)控，可被干旱、鹽度、ABA誘導(dǎo)[23]，鹽脅迫下編碼P5CS的基因表達(dá)上調(diào)，合成更多的脯氨酸幫助植物抵抗?jié)B透失衡的變化[24]。過(guò)表達(dá)P5CS基因的植物，包括小麥、甘蔗、水稻、馬鈴薯、柑橘和鷹嘴豆等[25-30]，體內(nèi)脯氨酸積累可以降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性來(lái)增強(qiáng)植物的應(yīng)急防御能力，使植物在不同的脅迫環(huán)境下維持基本的生理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥SgP5CS基因的表達(dá)明顯受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，這與黃文華[31]對(duì)蒙古冰草干旱脅迫下P5CS基因定量表達(dá)分析結(jié)果一致。

植物主要通過(guò)根系來(lái)維持自身的生長(zhǎng)需求，植物根系脯氨酸的運(yùn)輸和積累可以在極端的環(huán)境下通過(guò)不同調(diào)控途徑來(lái)促進(jìn)植株的根系生長(zhǎng)[32]。在鹽脅迫和干旱脅迫條件下，豇豆P5CS基因在鷹嘴豆和高粱中過(guò)表達(dá)，脯氨酸含量增加進(jìn)而促進(jìn)植物根系伸長(zhǎng)和根系生物量增加[30，33]。干旱脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)代謝和氧化反應(yīng)等方面的變化，適量的脯氨酸積累能夠使植物對(duì)有限的環(huán)境條件具備一定的適應(yīng)能力，這對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要的意義[34]。

本研究克隆堿蓬SgP5CS基因并導(dǎo)入到擬南芥中，使SgP5CS基因在擬南芥過(guò)表達(dá)后進(jìn)行相關(guān)的指標(biāo)測(cè)定和耐旱性鑒定，結(jié)果顯示，經(jīng)干旱脅迫誘導(dǎo)2周后，SgP5CS過(guò)表達(dá)的擬南芥植株的表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照，具有較長(zhǎng)的根系，同時(shí)游離脯氨酸的含量顯著增加而丙二醛含量顯著降低?？傊琒gP5CS基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥耐旱性，但SgP5CS基因在干旱脅迫下的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。