梁小妍，金玉珍，馬 麗，陳 雄

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院婦產(chǎn)科，上海200940)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是圍產(chǎn)兒發(fā)病和死亡的主要原因之一，其圍產(chǎn)兒患病率及死亡率為正常發(fā)育兒的4～6倍，不僅影響胎兒的宮內(nèi)發(fā)育，遠期也影響兒童期及青春期的體能與智能發(fā)育。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)FGR是成人疾病宮內(nèi)起源的病因之一[1]。引起FGR的原因包括胎兒、胎盤、母體及環(huán)境方面的因素。胎盤發(fā)育和功能障礙是最常見的引起FGR的原因，但引起FGR胎盤發(fā)育和功能障礙的確切機制尚不清楚[2-4]。Diplas等[5]通過分析FGR和正常妊娠胎盤組織中的印跡基因表達，發(fā)現(xiàn)被研究的印跡基因中17%(9/52)存在統(tǒng)計意義上的表達差異。這些研究表明印跡基因的表達異常可能是胎盤組織長期血流低灌注的一個原因。印記基因的表達異常與其甲基化水平密切相關(guān)，目前關(guān)于印記基因PEG10 DNA甲基化水平對FGR的影響研究較少。本研究通過分析印記基因PEG10 DNA在FGR患者胎盤組織的甲基化水平，探討印記基因的DNA甲基化水平在FGR發(fā)病中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究采取前瞻性研究，收集2014年1月至2017年1月在上海市第一人民醫(yī)院寶山分院婦產(chǎn)科住院分娩FGR者(研究組)56例，F(xiàn)GR患者不論診斷孕周，最終足月待產(chǎn)48例，早產(chǎn)患者8例；同時收集同期住院的正常足月分娩者(對照組)56例為研究對象。所有入選者簽署知情同意書，并經(jīng)我院倫理委員會審查批準。

1.2研究對象納入標準

所有孕婦均系單胎、月經(jīng)周期規(guī)律、末次月經(jīng)清楚、排除肝腎功能異常、無妊娠合并癥及并發(fā)癥、無宮縮、剖宮產(chǎn)分娩者。兩組孕婦均排除既往不良妊娠史、原發(fā)高血壓、糖尿病、慢性腎炎、心臟及免疫系統(tǒng)疾病等慢性疾病史。無輸血及免疫治療史。同時所有入選對象均無妊娠合并癥。

研究組因在住院監(jiān)護期間，因胎監(jiān)異常提前終止妊娠4例(孕34～36周)，羊水急劇減少終止妊娠4例(孕33～36周)。FGR患者的診斷標準參照全國高等學校教材《婦產(chǎn)科學》第8版，其中B超檢查胎兒和頭圍的比值小于同孕周平均值的第10百分位數(shù)，考慮可能為FGR。

1.3試驗方法

1.3.1標本的選取

所有標本均在胎盤娩出15min內(nèi)，無菌剪取胎盤臍帶根部附著區(qū)域母體面中央部位組織3～4塊，約1.0cm×1.0cm×1.0cm大小，避開出血、壞死及鈣化的區(qū)域。用滅菌PBS溶液漂洗干凈，其中1塊置于經(jīng)DEPC水處理并消毒的凍存管中，其余全部迅速置于液氮中，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ砹羧⌒迈r組織約1.5cm×1.5cm×1.5cm小塊置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化測定。

1.3.2 DNA的提取

按照試劑盒(QIAamp DNAFFPETisue)操作步驟對DNA進行提取。采用紫外分光光度儀檢測DNA含量。選取A260nm/A280nm比值為1.8～2.0的標本為研究對象。

1.3.3亞硫酸鹽處理及純化

取基因組DNA 1μg，嚴格按照Epi Tect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN，cat：59824)說明書進行DNA亞硫酸氫鹽修飾處理，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏げ桓淖?。Meth Primer軟件設計其3個CPG島特有3引物，見表1，引物由上海世濟公司合成。PCR擴增總體系50μL，加入經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板2μL，2×PCR buffer 25μL，上下游引物各1μL，用雙蒸水調(diào)整至終體積為50μL。PCR條件及設定反應程序：95℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，運行40個循環(huán)；72℃修復延伸5min結(jié)束反應。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，按照試劑盒(Generay，cat：GK2043)回收目的片段并純化。

表1印記基因PEG10 CPG島引物序列

Table 1 Primer sequence of island CPG in imprinted gene PEG10

1.3.4 BSP測序

回收DNA與載體pTG19-T(Generay公司)4℃連接過夜，取10μL連接產(chǎn)物與XL10-Gold感受態(tài)細胞冰浴20min，42℃熱激45s后，再在冰中放置2min，加入500μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min；在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數(shù)白色、藍色菌落，酶切法鑒定陽性菌落。每個挑取10個陽性單克隆質(zhì)粒送華大基因測序，華大基因測序中心運用BiQ-analyzer軟件分析測序結(jié)果并繪圖。

1.4統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1兩組的臨床資料

研究組與對照組的年齡、孕周、孕次及體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表2。

2.2兩組胎盤病理形態(tài)學改變情況

研究組胎盤不同程度的絨毛發(fā)育不良(膜狀胎盤及輪廓胎盤各4例)，合體結(jié)節(jié)增多(5例)，纖維蛋白沉積(14例)，絨毛膜炎(6例)，甚至終末絨毛缺乏(2例)，總體病理學改變發(fā)率占62.50%(35/56)，對照組終末絨毛豐富，其中只有8例發(fā)生胎盤鈣化，病理學改變率僅為14.29%(8/56)，兩組比較差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(χ2=27.52，P<0.05)，見圖1。

組別 例數(shù)(n)年齡(歲)孕周(周)孕次(次)孕婦分娩前BMI(kg/m2)對照組5627.08±3.0737.67±0.541.56±0.4866.83±4.03研究組5626.80±2.7537.42±0.561.48±0.4266.76±3.82t0.512.410.940.09P0.680.050.360.16

2.3兩組胎盤印記基因PEG10 DNA甲基化水平

研究組胎盤組織印記基因PEG10 DNA甲基化水平在CPG島1無明顯差異，而在CPG島2及CPG島3明顯高于對照組，尤其以CPG島2最為明顯，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖2、表3。

注：1為正常胎盤組織(HE×20)；2為FGR胎盤組織(HE×20)，箭頭所指為纖維蛋白沉積。

圖1正常妊娠及FGR患者胎盤組織形態(tài)變化

Fig.1 Morphological changes of placental tissue in normal pregnancy and FGR patients

注：A是正常妊娠與FGR胎盤組織CPG島1的甲基化程度，1為正常妊娠胎盤組織CPG島1的甲基化程度，2為FGR胎盤組織CPG島1的甲基化程度；B是正常妊娠與FGR胎盤組織CPG島2的甲基化程度，1為正常妊娠胎盤組織CPG島2的甲基化程度，2為FGR胎盤組織CPG島2的甲基化程度；C是正常妊娠與FGR胎盤組織CPG島3的甲基化程度，1為正常妊娠胎盤組織CPG島3的甲基化程度，2為FGR胎盤組織CPG島3的甲基化程度；每個橫向的圓圈串代表一個單克隆測序結(jié)果(每個胎盤樣品都有10個)，每個圓圈串上21個圓圈代表擴增目的片段上的21個CPG位點，其中實心的圓圈代表該CPG位點上C是甲基化的，空心的圓圈代表該CPG位點上C是未甲基化的。

圖2重亞硫酸鹽修飾測序(BSP)檢測胎盤組織印記基因PEG10 DNA甲基化水平

Fig. 2 Methylation level of imprinted gene PEG10 DNA detected by heavy sulfite-Modified sequencing (BSP) in placenta tissue

組別CPG島1CPG島2CPG島3研究組1×10-3±1×10-30.544±0.0270.245±0.041對照組1×10-3±2×10-30.152±0.0150.287±0.023t0.0294.977.16P0.830.000610.0005

3討論

3.1 FGR與滋養(yǎng)細胞的關(guān)系

影響胎兒生長的因素涉及多個方面，但胎盤因素是最主要因素之一，胎盤供血不足、滋養(yǎng)細胞缺血、缺氧是FGR的病理實質(zhì)[6]。而具有父系特征的父源性印跡基因的主要功能是促進滋養(yǎng)細胞的增殖分化和浸潤[7]；將單性生殖的胚胎移植于子宮，發(fā)現(xiàn)單雄生殖的胚胎發(fā)育缺陷，胚外細胞系-滋養(yǎng)葉生長過度，浸潤能力強，形成胎盤較大。而單雌生殖動物滋養(yǎng)葉、胎盤形成能力不足。這表明父方來源印記基因主要調(diào)節(jié)滋養(yǎng)葉的生長及胎盤形成[8]。胎盤的早期發(fā)育取決于胎盤滋養(yǎng)細胞的浸潤和血管的形成[9]，已證實胎盤滋養(yǎng)細胞浸潤和遷移異常會導致胎盤發(fā)育異常，母嬰血流交換下降，誘發(fā)FGR。

3.2印記基因PEG10甲基化參與滋養(yǎng)細胞發(fā)育

PEG10屬于父方表達而母方印記的重要印記基因[10-11]。在前期研究正常妊娠細胞滋養(yǎng)層細胞(cytotrophoblasts，CTB)和絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillous trophpblast，EVT)基因表達譜(Affymetrix芯片)中發(fā)現(xiàn)，有許多基因高表達，PEG10就是其中之一[12]，并且PEG10可能參與子癇前期[13]。而FGR、妊娠期高血壓疾病患者的胎盤中存在類似的核心病理變化?；蛴∮浭怯蒁NA甲基化差異標記父本和母本的基因組，DNA甲基化是印記基因表達調(diào)控主要機制[14]之一。本研究結(jié)果顯示FGR患者胎盤病理學改變發(fā)生率為62.50%(35/56)，主要表現(xiàn)為不同程度的絨毛發(fā)育不良，合體結(jié)節(jié)增多，纖維蛋白沉積，絨毛膜炎，甚至終末絨毛缺乏。同時，父方表達的印記基因PEG10在FGR患者胎盤組織高度甲基化，而在正常妊娠胎盤組織其甲基化程度明顯降低。尤其是以CPG島2為主的高甲基化。而在本研究結(jié)果中顯示印記基因PEG10過度甲基化，其主要機制可能是印記基因PEG10過度甲基化，轉(zhuǎn)錄活性減弱，蛋白表達降低，從而導致了父方基因?qū)ψ甜B(yǎng)細胞的增殖分化和浸潤作用降低，最終導致FGR發(fā)生。

綜上所述，父方表達印記基因PEG10的甲基化程度可能參與FGR的發(fā)生，而其在FGR發(fā)病的主要調(diào)控是通過其表觀遺傳修飾甲基化程度來體現(xiàn)。通過上述研究為進一步闡明印記基因在FGR發(fā)病中的機制奠定了一定的基礎，同時提示表觀遺傳修飾可能在胚胎發(fā)育及其生長中有著不可忽略的作用。