張星光，馬建婷，傅云雀，傅家欣

(浙江省余姚市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江余姚315400)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指活性子宮內(nèi)膜組織種植在子宮腔外所引起的一組癥候群，是一種激素依賴性婦科疾病，好發(fā)于育齡期婦女[1]，臨床多表現(xiàn)為進行性加重的盆腔粘連、疼痛、不孕等癥狀，并有類似惡性腫瘤種植、向周圍組織侵襲及復(fù)發(fā)的生物學(xué)行為，嚴(yán)重影響患病婦女的身心健康和生活質(zhì)量[2]。EMs的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病年齡越來越趨于年輕化[3]。EMs的發(fā)病機制目前尚未明確，多以Sampson經(jīng)血逆流種植學(xué)說為主導(dǎo)理論[4]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路與EMs疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注[5]。

本研究通過對比EMs患者異位子宮內(nèi)膜和非EMs患者正常子宮內(nèi)膜中β-catenin、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)和微血管密度(mierovasuclardensvit，MVD)的表達(dá)情況，同時結(jié)合EMs患者手術(shù)前后的血清CA125水平，分析Wnt/β-catenin信號通路在EMs侵襲發(fā)生機制中的作用及與疾病復(fù)發(fā)的相關(guān)性，為EMs靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2012年7月至2014年12月期間在余姚市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院并行手術(shù)治療的EMs患者的異位子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本100例作為觀察組。按照美國生育協(xié)會EMs分期標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)[6]進行分期，其中Ⅰ期21例，患者年齡為25～47歲，平均(34.9±5.8)歲；Ⅱ期38例，患者年齡為23～49歲，平均(37.1±6.4)歲；Ⅲ期26例，患者年齡為24～48歲，平均(36.4±5.3)歲；Ⅳ期15例，患者年齡為26～50歲，平均(37.8±7.2)歲。另收集同期因其他婦科良性疾病入院治療患者的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本100例作為對照組，患者年齡為25～46歲，平均(37.2±6.1)歲。

所選患者均無其他內(nèi)外科合并癥，且術(shù)前3個月內(nèi)未進行過激素類藥物治療。所收集標(biāo)本均經(jīng)病理證實為EMs。兩組患者在年齡、婦科合并癥、疾病分期等一般資料上比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，標(biāo)本提供者已簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1免疫組化法檢測β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在組織標(biāo)本中的表達(dá)強度

對標(biāo)本進行常規(guī)石蠟包埋，行連續(xù)切片，厚約4～5μm；組織切片脫蠟、梯度酒精水化；以新配制3%H2O2浸泡20min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)(pH=6)；滴加5% BSA液封閉15min；滴加1:80稀釋的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD一抗，4℃孵育過夜。次日滴加山羊抗兔IgG二抗37℃孵育20min，每步間以PBS沖洗5min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明，封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，以已知高表達(dá)組織陽性切片作為陽性對照。顯微鏡下觀察免疫組化切片，以胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。以Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件對鏡下染色圖片進行分析，病灶區(qū)內(nèi)隨機選取5個具有代表意義的高倍視野(×400倍)，取平均光密度值反映β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的陽性表達(dá)強度。

1.2.2檢測EMs患者手術(shù)前后血清CA125的水平

對100例EMs患者手術(shù)前后分別于清晨空腹抽取靜脈血3mL，室溫下靜置1h后3 000r/min離心，取上層血清，-80℃保存待用。采用羅氏Cobas-6000生化免疫分析儀，以化學(xué)發(fā)光法檢測血清中CA125的水平，以大于正常參考值35IU/mL為陽性。

1.2.3 EMs患者復(fù)發(fā)情況

于手術(shù)1年后對EMs患者進行隨訪，記錄其復(fù)發(fā)情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組免疫組化結(jié)果的比較

β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織的腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，以腺上皮細(xì)胞表達(dá)為主，顯色為棕黃色或棕褐色，見圖1。

觀察組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的平均光密度值均顯著高于對照組(t值分別為3.254、5.426、2.537、2.091，均P<0.05)，觀察組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)情況與EMs分期均呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.834、0.651、0.588、0.742，均P<0.05)，其表達(dá)強度均隨著EMs分期增高而增高，見表1。

表1 兩組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)及血清CA125水平的比較結(jié)果

注：*與對照組相比P<0.05；#與術(shù)前相比P<0.05。

2.2 EMs患者異位子宮內(nèi)膜β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表達(dá)強度與血清CA125水平的相關(guān)性

EMs患者術(shù)后血清CA125水平顯著低于術(shù)前水平(t=8.375，P<0.05)，EMs患者手術(shù)前、后血清CA125水平均與EMs分期呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.622、0.781，均P<0.05)，其水平均隨著EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表達(dá)強度增高而增高，見圖1。

注：圖A1～A4分別代表觀察組的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD；圖B1～B4分別代表對照組的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD。

圖1典型免疫組化圖像

Fig.1 Typical images of immunohistochemical assay

2.3 EMs患者異位子宮內(nèi)膜β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)強度與復(fù)發(fā)的相關(guān)性

手術(shù)1年后對EMs患者進行隨訪，100例EMs患者復(fù)發(fā)11例，其中Ⅱ期EMs患者復(fù)發(fā)2例，Ⅲ期復(fù)發(fā)4例、Ⅳ期復(fù)發(fā)5例，未見Ⅰ期復(fù)發(fā)患者，EMs患者復(fù)發(fā)例數(shù)隨著分期增高呈現(xiàn)增長趨勢，表明β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)強度與EMs復(fù)發(fā)情況呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，但由于復(fù)發(fā)例數(shù)較少，每期各指標(biāo)的表達(dá)強度與復(fù)發(fā)例數(shù)的相關(guān)性檢驗差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

3討論

3.1 Wnt/β-catenin信號通路與EMs發(fā)病的相關(guān)性

Wnt/β-catenin信號通路在人類生物學(xué)的各個方面都發(fā)揮著重要作用。已有研究證明，Wnt/β-catenin信號通路激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有聯(lián)系，其不僅可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化，還可參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[7]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路與EMs發(fā)病的相關(guān)性已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，其可能在促進異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附、侵襲和血管生成過程中起著關(guān)鍵作用[1]。β-catenin是Wnt信號通路的重要調(diào)節(jié)因子之一，該通路可參與調(diào)控細(xì)胞的生長與增殖[8]，異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞可能存在β-catenin的蓄積現(xiàn)象，當(dāng)β-catenin高表達(dá)時，Wnt信號通路可激活為開放狀態(tài)，同時可促進其下游因子VEGF和MMP-9的表達(dá)，當(dāng)β-catenin低表達(dá)時，Wnt信號通路呈閉合狀態(tài)，VEGF和MMP-9的表達(dá)均顯著下降[5，9]。本研究對比分析了EMs患者異位子宮內(nèi)膜和非EMs患者正常子宮內(nèi)膜中β-catenin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，β-catenin在異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，以腺上皮細(xì)胞表達(dá)為主。觀察組β-catenin的表達(dá)強度均顯著高于對照組(均P<0.05)，且表達(dá)情況與EMs分期呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。

3.2 VEGF、MMP-9和MVD與EMs發(fā)病的相關(guān)性

研究發(fā)現(xiàn)，EMs患者腹腔內(nèi)以病灶為中心的放射狀血管增生是該病的特征性改變之一，異位子宮內(nèi)膜中的毛細(xì)血管總表面積較正常子宮內(nèi)膜顯著增加，可見，新血管生成現(xiàn)象在EMs的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用[10]。VEGF是一種具有高度特異性的血管生成因子，其可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、增加血管通透性、促進血管舒張、改善細(xì)胞外基質(zhì)等方式，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘發(fā)新生血管形成[11-12]。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體蛋白在EMs患者在位和異位子宮內(nèi)膜中的水平均明顯升高，表明VEGF可能參與了子宮內(nèi)膜細(xì)胞異位種植過程中的血管形成過程[13-14]。MMP-9是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最大的明膠酶，其能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠等主要成分，并能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，誘發(fā)新生血管生成，同時還可通過與整合素的相互活化而加強細(xì)胞間的黏附作用，進而可能在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位黏附、種植、生長過程中發(fā)揮一定作用[15]。此外，MVD是對血管最密集部位進行的微小血管計數(shù)，是新生血管生成定量描述的金標(biāo)準(zhǔn)。子宮內(nèi)膜黏附時，須有新生血管的建立才能維持內(nèi)膜的生存與發(fā)展，內(nèi)膜組織中MVD越高說明新生毛細(xì)血管越豐富，異位子宮內(nèi)膜本身及其周圍組織新的血供的建立和維持是EMs發(fā)生的基礎(chǔ)條件。

上述重要的細(xì)胞因子均可能參與了EMs的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。本研究對比分析EMs患者異位子宮內(nèi)膜和非EMs患者正常子宮內(nèi)膜中VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)情況，結(jié)果顯示VEGF、MMP-9和MVD在異位子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，以腺上皮細(xì)胞表達(dá)為主。觀察組VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)強度均顯著高于對照組(均P<0.05)，且各指標(biāo)的表達(dá)情況與EMs分期均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)。

3.3血清CA125水平與EMs發(fā)病及復(fù)發(fā)的相關(guān)性

EMs是一個激素依賴性疾病，患者接受治療多以保守手術(shù)為主，即只切掉病灶，保留卵巢、子宮、子宮內(nèi)膜等。由于患者激素依舊處于分泌比較旺盛的階段，因而較易引起疾病復(fù)發(fā)，即一段時間后再次出現(xiàn)臨床癥狀，其程度可達(dá)到治療前水平甚至加重，EMs保守術(shù)后年復(fù)發(fā)率可達(dá)10%，5年復(fù)發(fā)率可達(dá)20%～40%[16]。CA125是體腔上皮細(xì)胞分泌的一種高分子糖蛋白表面抗原，可作為卵巢癌的診斷標(biāo)記物，近年來也開始用于EMs的診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測，可作為臨床上EMs的血清學(xué)輔助檢測指標(biāo)[17]。黃蓉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CA125與EMs的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，其水平隨著EMs分期增加而呈升高趨勢。

本研究結(jié)合EMs患者手術(shù)前后的血清CA125水平、EMs分期及術(shù)后復(fù)發(fā)情況，分析β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的蛋白表達(dá)強度與復(fù)發(fā)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，EMs患者術(shù)后血清CA125水平顯著低于術(shù)前水平(P<0.05)，手術(shù)前、后血清CA125水平與EMs分期均呈顯著正相關(guān)(均P<0.05)；手術(shù)1年后100例EMs患者復(fù)發(fā)11例，EMs患者復(fù)發(fā)例數(shù)與EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達(dá)強度亦呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，但由于復(fù)發(fā)例數(shù)較少，相關(guān)性檢驗差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

綜上所述，β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的高表達(dá)與EMs發(fā)病相關(guān)，表明Wnt/β-catenin信號通路對EMs的遷移和侵襲過程有一定的影響，且影響越大，術(shù)后疾病的復(fù)發(fā)可能性越大。