張雅莉，王林生，*

(1.河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽市作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，河南 洛陽 471023)

赤霉病是由禾谷類鐮刀菌(Gibberellazeae(Schw.) Petch)引起的小麥災難性病害，被稱為小麥“癌癥之王”[1]。2000年前赤霉病是我國長江中下游冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)和華南冬麥區(qū)的主要病害。隨著全球氣候變暖、栽培耕作制度的改變，赤霉病發(fā)生越來越頻繁，發(fā)生區(qū)域不斷擴大，范圍越來越廣。近些年，在北方黃淮麥區(qū)和關(guān)中麥區(qū)，赤霉病屢有發(fā)生，已上升為主要病害，成為影響該區(qū)域小麥產(chǎn)量的重要因素。與此同時，由禾谷類鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇真菌毒素(deoxynivalenol，DON)，直接在小麥籽粒中積累進入食物鏈，嚴重威脅人類健康[2-4]。培育抗病品種可以抑制赤霉病菌侵染，降低毒素在籽粒中的累積，是一條經(jīng)濟有效的途徑。但赤霉病抗源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，致使培育高產(chǎn)抗病品種的選育進展緩慢，已成為一個世界性難題[5]。而化學藥劑防治既污染環(huán)境又會導致禾谷類鐮刀菌產(chǎn)生抗藥性，對感病品種也難以達到理想防治效果。因此，拓寬赤霉病種質(zhì)資源，加快抗病新品種選育是一條長期、安全和可靠的策略。

大賴草(Leymusracemosus)是一種與小麥親緣關(guān)系較遠的多年生植物，具有耐鹽、抗旱、抗多種病害等優(yōu)良特性[6-7]，尤其高抗赤霉病，是一種具有潛在應(yīng)用價值的基因資源。南京農(nóng)業(yè)大學1983年將大賴草的赤霉病抗性基因?qū)肫胀ㄐ←湥x育出具有較高赤霉病抗性的普通小麥-大賴草異附加系A(chǔ)ddLr.2”、AddLr.7”和AddLr.14”[8]；Wang等[9]證明7Lr#1S上存在抗赤霉病的主效基因；Qi等[10]把7Lr#1S攜帶的抗赤霉病基因Fhb3定位在該染色體的近端部；并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制了一批攜帶大賴草赤霉病抗病基因的小麥大賴草易位系[11-13]，在生產(chǎn)上進行了初步嘗試，表現(xiàn)出良好的效果。

本研究采用電離輻射處理附加系DA7Lr的花粉，誘導易位系。利用染色體C-分帶、熒光原位雜交、分子標記技術(shù)和赤霉病抗性鑒定等技術(shù)，對抗赤霉病的普通小麥-大賴草異附加系DA7Lr成熟花粉輻射的后代進行鑒定，篩選出抗赤霉病的普通小麥-大賴草易位系，為小麥抗赤霉病育種提供新的種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用60Co-γ射線(劑量1 200 Rad，劑量率100 Rad·min-1)照射普通小麥-大賴草二體異附加系DA7Lr開花期麥穗，取其輻射花粉與普通小麥中國春雜交，讓其后代種子自交，鑒定出純合易位系?？钩嗝共φ掌贩N蘇麥3號和感赤霉病品種中國春由河南科技大學農(nóng)學院小麥遺傳育種研究室引進保存。

1.2 染色體制片

1.2.1 根尖細胞有絲分裂中期

將小麥種子放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽(23 ℃)，待根長至1.0～2.0 cm時，剪取1～2條種子根在冰水中處理20～24 h。用無水乙醇冰醋酸混合液(體積比3∶1)固定，4 ℃冰箱中保存3 d后于45%醋酸中進行根尖壓片，相差顯微鏡下染色體觀察，放入-70 ℃冰箱或液氮中冷凍揭去蓋玻片，脫水備用。

1.2.2 花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ

挑取處于減數(shù)分裂中期Ⅰ的花藥，用上述固定液固定，按根尖細胞有絲分裂中期制片方法壓片。

1.3 染色體C-分帶和熒光原位雜交

參照Gill等[14]的方法進行染色體C-分帶。熒光原位雜交參照Mukai等[15]的方法稍加修改進行。參照Zhang等[16]的方法順次原位雜交，首先以熒光素Fluorescein-l2-dUTP標記的大賴草基因組DNA為探針進行基因組原位雜交，通過SPOT CCD(charge coupled device)獲取FISH圖像，然后將信號洗脫，再以紅色熒光標記的B組?；结極ligo-pSc119.2-2(其寡核苷酸重復序列為6-FAM-5′-TTCCA CGATT GACGATTCCG GGGGT GCGTTTACGT GTCCG TCGTC-3′)和綠色熒光標記的D組?；结極ligo-pAs1-2(其寡核苷酸重復序列為Tamra-5′-CATTT CATCC ACATAGCATG TGCAA GAAAT TTGAGAGGGT TACGG CAAAA ACTGGAT-3′)進行雙色熒光原位雜交，用DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色。SPOT CCD(charge coupled device)獲取圖像。圖像結(jié)果參照Tang等[17]的標準FISH圖譜進行分析。實驗過程中采用的綠色熒光素和兩種?；结樂謩e由上海英俊生物科技有限公司提供和合成。

1.4 分子標記鑒定

植物DNA提取參照Sharp等[18]的SDS法。采用10 μL PCR反應(yīng)體系，模板DNA 20 ng、1.5 mmol L-1MgCl2、1×buffer、200 mmol L-1dNTP、終濃度各為0.2 μmol L-1的左右引物、0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后照相分析。

1.5 赤霉病抗病性鑒定

抗性鑒定在河南科技大學開元校區(qū)農(nóng)場進行，試驗按照隨機區(qū)組設(shè)計。采用王裕中等[19]的單花滴注法接種禾谷鐮刀菌(菌種由河南科技大學林學院植物病理系徐建強博士提供)，接種后早晚2次噴霧，保證禾谷鐮刀菌的發(fā)病濕度。2015—2017年連續(xù)3年均使用編號為LHLY-2高強毒菌株分生孢子懸浮液。每小區(qū)接種10穗，接種21 d后，調(diào)查接種穗的發(fā)病小穗數(shù)和總小穗數(shù)，計算病小穗率。調(diào)查結(jié)果采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的分子細胞學鑒定

利用電離輻射處理普通小麥大賴草異附加系DA7Lr開花期的穗子，取其輻射花粉授予已去雄的普通小麥中國春，對其輻射后代種子，進行根尖細胞染色體熒光原位雜交(FISH)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株編號為NGH-03單株具有1條普通小麥-大賴草易位染色體，從自交后代種子中得到了1株含有2條易位染色體的單株，根尖細胞有絲分裂中期染色體制片，相差顯微鏡下觀察。

以綠色熒光標記大賴草基因組DNA和以紅色熒光標記的小麥B組?；结極ligo-pSc119.2-2作為探針，對分裂相較好的NGH-03純合種子根尖染色體制片進行雙色熒光原位雜交(GISH-FISH)。結(jié)果顯示：在熒光顯微鏡下，可以觀察到易位染色體的大賴草片段端部處有很強的綠色熒光雜交信號，易位染色體的小麥片段未出現(xiàn)紅色Oligo-pSc119.2-2雜交信號(圖1-a)。該易位染色體為大賴草7Lr短臂端部片段與小麥某染色體的部分片段發(fā)生的頂端易位。

為了進一步確定易位染色體中小麥染色體片段的身份，將雙色雜交信號洗脫，再以綠色熒光標記的小麥D組?；结極ligo-pAs1-2進行原位雜交。結(jié)果顯示：在易位小麥染色體近著絲粒處有兩個明顯的綠色Oligo-pAs1-2雜交位點(圖1-b)。參照Tang等[17]的原位雜交圖譜，發(fā)現(xiàn)D組的7對染色體，在其長臂和短臂的端部和近端部均有較強的雜交信號，因此可排除D組染色體。B組染色體只有3B染色體的長臂、6B染色體的短臂以及7B染色體的兩臂端部和近端部有雜交信號，這3對染色體也可排除。A組染色體中，1A和2A短臂的端部，4A染色體長臂的端部有明顯的雜交信號，7A染色體兩臂端部有弱的雜交信號；1A和5A染色體長臂的近中部有明顯雜交信號，只有3A染色體短臂在近著絲粒處有明顯的雜交信號。C-分帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)易位的小麥染色體臂上近著絲粒處有2個較清晰的點狀帶紋，著絲粒處C帶不強，也符合3A染色體的C帶特點(圖2)，因此可推測易位涉及的小麥染色體為3A。

a圖中綠色信號為Fluorescein-12-dUTP標記的大賴草基因組DNA；b圖中的紅色信號為Tamra標記的Oligo-pSc119.2-2，綠色信號為6-FAM標記的Oligo-pAs1-2；箭頭指示易位染色體。In panel a， L. racemosus genomic DNA was labeled with fluorescein-12-dUTP and visualized with green signals. In panel b， Oligo-pSc119.2-2 was labeled with Tamra and visualized with red signals， and Oligo-pAs1-2 was labeled with 6-FAM and visualized with green signals. The arrows showed translocation chromosomes.圖1 易位系T3AS·3AL-7Lr#1S熒光原位雜交Fig.1 Fluorescence in situ hybridization (FISH) of translocation line T3AS·3AL-7Lr#1S

對其花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體制片進行DAPI染色，熒光顯微鏡下鏡檢分析其染色體構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)其易位染色體正常配對，形成了穩(wěn)定的環(huán)狀二價體(圖3)，該易位系命名為T3AS·3AL-7Lr#1S。

2.2 易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的分子標記鑒定

根據(jù)小麥第7部分同源群不同區(qū)段的EST序列合成了81對EST-STS引物。其中有3對引物發(fā)現(xiàn)在大賴草、DA7Lr和易位系T3AS·3AL-7Lr#1S上有特異擴增，它們是BE591127、BQ168298和BE591737，均定位在第7同源群的7DS、7AS和7BS上，擴增出的3條特異條帶，大小分別約1 000、1 733和398 bp(圖4)。因此，可以利用這3對特異引物追蹤大賴草染色體片段，鑒定含有該大賴草染色體片段的易位染色體。

2.3 易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的赤霉病抗性鑒定

從左至右依次為：C分帶的3A，C分帶的T3AS·3AL-7Lr#1S，熒光原位雜交的T3AS·3AL-7Lr#1S，Oligo-pAs1-2(綠色)雜交的T3AS·3AL-7Lr#1S，Oligo-pAs1-2(紅色)雜交的3A，熒光原位雜交的7Lr，C分帶的7Lr。The pictures from left to right showed C-banded 3A， C-banded T3AS·3AL-7Lr#1S， FISH T3AS·3AL-7Lr#1S， T3AS·3AL-7Lr#1S with Oligo-pAs1-2(green)， 3A with Oligo-pAs1-2 (red)， FISH 7Lr and C-banded 7Lr， respectively.圖2 易位染色體T3AS·3AL-7Lr#1S的C分帶及熒光原位雜交Fig.2 C-banding and FISH of the translocation chromosomeT3AS·3AL-7Lr#1S

圖中紅色信號為熒光素CY3-dUTP 標記的大賴草基因組DNA，箭頭指示配對的二價體易位染色體T3AS·3AL-7Lr#1S。L. racemosus genomic DNA was labeled with CY3-dUTP and visualized with red signals. The arrow showed the ring bivalent formed by a pair of translocation T3AS·3AL-7Lr#1S.圖3 易位系T3AS ·3AL-7Lr#1S的花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的熒光原位雜交Fig.3 Chromosome FISH at MⅠ of PMC of translocation line T3AS·3AL-7Lr#1S

M，Marker；1，中國春；2，大賴草；3，DA7Lr；4，T3AS·3AL-7Lr#1S。M， Marker; 1， Chinese Spring; 2， L. racemosus; 3， DA7Lr; 4， T3AS ·3AL-7Lr#1S.圖4 三對引物的PCR擴增結(jié)果Fig.4 Amplification results of three pairs of primers

經(jīng)過連續(xù)3年的赤霉病接種鑒定，結(jié)果表明，易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的病小穗率顯著低于感病親本中國春和感病對照綿陽85-45，但稍高于抗病對照蘇麥3號(表1、圖5)，表現(xiàn)出了較好的赤霉病抗性。

3 討論

表1T3AS·3AL-7Lr#1S的赤霉病病小穗率

Table1Evaluation of scab resistance of T3AS·3AL-7Lr#1S

材料Material大田鑒定病小穗率Scab resistance identified in field/%2015年2016年2017年T3AS·3AL-7Lr#1S9.1313.16±6.52??10.36±9.28??蘇麥3號Sumai 33.906.35±3.12??5.69±2.14??中國春35.2739.58±7.9630.90±8.92Chinese Spring綿陽85-4549.2356.32±11.26??47.83±13.25??Mianyang 85-45

**表示試驗材料與中國春在0.01概率水平上有顯著差異。

** indicated the significant difference atP<0.01 between the material and Chinese Spring.

從左到右依次為：T5AS-7LrL·7LrS、中國春、綿陽85-45、蘇麥3號。The pictures from left to right showed T3AS·3AL-7Lr#1S， Chinese Spring， Mianyang 85-45 and Sumai 3， respectively.圖5 易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的赤霉病抗性鑒定Fig.5 Evaluation of scab resistance of translocation line T3AS·3AL-7Lr#1S

赤霉病頻繁發(fā)生已成為我國小麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害，對小麥產(chǎn)量帶來嚴重影響，產(chǎn)生的真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)對小麥食品安全構(gòu)成了嚴重威脅，長期采用化學藥劑防治不僅引起病害的抗藥性，也會造成環(huán)境污染。培育抗赤霉病品種是防治赤霉病經(jīng)濟有效的途徑，但由于抗赤霉病的親本資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，抗赤霉病品種選育陷入了瓶頸。2017年國審通過的20個半冬性小麥品種及河南省審定通過的27個小麥品種全部高感赤霉病，致使我國小麥主產(chǎn)區(qū)黃淮麥區(qū)存在巨大的安全隱患。因此，迫切需要拓寬小麥育種的赤霉病種質(zhì)抗源。

盡管蘇麥3號小麥是目前世界公認的最好的赤霉病抗性種質(zhì)[20]，但由于其雜交后代抗性選擇效果差，農(nóng)藝綜合性狀不夠理想，實現(xiàn)高產(chǎn)與抗病的有機結(jié)合比較困難，很難發(fā)揮其應(yīng)有的作用，小麥品種間抗源的選擇難以有突破性進展。小麥野生近緣植物抗赤霉病性給抗病育種抗源選擇提供了新的思路。大賴草作為普通小麥的近緣野生植物，高抗小麥赤霉病，早已引起研究者的高度重視。自1983年，農(nóng)業(yè)部作物細胞遺傳重點實驗室(南京農(nóng)業(yè)大學)選育出高抗赤霉病的普通小麥大賴草異附加系以來，遺傳育種工作者采用電離輻射、殺配子染色體誘導等方法創(chuàng)造了一批普通小麥-大賴草易位系，拓寬了抗赤霉病的新種質(zhì)，起到了良好的示范作用。本研究通過電離輻射小麥-大賴草二體附加系DA7Lr花粉創(chuàng)造出的普通小麥-大賴草易位系T3AS·3AL-7Lr#1S，經(jīng)大田鑒定高抗小麥赤霉病，可以作為赤霉病抗性育種的中間材料。

采用電離輻射將外源有益基因?qū)肫胀ㄐ←準莿?chuàng)造小麥新種質(zhì)的常用方法[21-22]，在小麥種質(zhì)創(chuàng)新過程中，發(fā)揮了非常重要的角色。但由于電離輻射造成染色體斷裂重接隨機性強，產(chǎn)生的易位染色體補償性往往較差，直接利用尚存在一定困難，因此，創(chuàng)造攜帶外源有益基因的補償性易位和小片段易位，尤其是中間插入易位已成為研究者追求的目標。本研究采用電離輻射的方法創(chuàng)造普通小麥大賴草易位系，并利用C-分帶、GISH-FISH雙色熒光原位雜交技術(shù)，鑒定出了易位系T3AS·3AL-7Lr#1S，并篩選出了3個在易位系T3AS·3AL-7Lr#1S上有特異擴增的EST-STS多態(tài)性標記BE591127、BQ168298和BE591737，可有效追蹤大賴草染色體片段。所獲易位系T3AS·3AL-7Lr#1S對赤霉病表現(xiàn)了較好的抗性，但由于其遺傳背景是小麥中國春，農(nóng)藝性狀較差，植株較高，達101 cm；生育期較長(236 d)，比對照品種偃展4110晚熟7 d以上，千粒重較低(29.5 g)，穗子頂端有禿尖，小穗基部小花有缺位現(xiàn)象，很難直接利用，因此，仍需要進一步回交改良。