陳平 林建光 戴煬斌 趙愛月 戴毅君 綜述 許天文 審校

近年來，以免疫檢查點為藥物靶點的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）成為治療腫瘤的前景藥物。大量研究證實了ICI在臨床中的有效性，但仍有較多接受ICI治療的患者未獲益。提高免疫治療的臨床應答率，尋找免疫治療生物標志物成為免疫治療能否突破的當務之急。腸道菌群是近年來新興的免疫生物標志物之一，本文旨在根據(jù)現(xiàn)有研究闡述腸道菌群如何影響機體免疫治療，尋找提高ICI療效的可能性。

1 腸道菌群和免疫治療

2015年有研究報道，在小鼠模型中，腸道菌群對PD-1 類免疫治療起決定性作用，無菌小鼠存在免疫缺陷，糞便移植和口服差異細菌可逆轉這種缺陷［1-2］。隨后3項同期研究［3-5］顯示，在免疫治療的前2個月和治療后的1個月使用廣譜抗生素，使體內細菌（包括腸道菌群）紊亂，導致總生存期（overall survival，OS）、無進展生存期（progression free survival，PFS）顯著降低，這類結果同樣可通過移植糞便逆轉。將對PD-1療效的患者糞便移植到抗生素小鼠模型上，能恢復小鼠重新獲得ICI 免疫治療的響應。上述研究還發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者腸道細菌的豐富度是影響免疫治療反應的主要因素。不同的菌群對免疫療法的影響存在差異，菌群分為“好菌群”和“壞菌群”。國內外研究得出的“好菌群”不盡相同，地域差別也是影響因素之一（表1）。

2 腸道菌群影響免疫治療療效的機制探索

2.1 腸道菌群通過影響免疫系統(tǒng)發(fā)育和調節(jié)決定ICI療效

ICI 治療的實質是解放免疫系統(tǒng)的“剎車“效應，微生物群通過影響機體免疫系統(tǒng)間接決定ICI療效，是治療過程中潛在的生理機制之一。如無菌小鼠的免疫系統(tǒng)極不發(fā)達［9］，缺乏有效的抗腫瘤適應性免疫和腫瘤壞死因子依賴性壞死反應，因此ICI難以在此類免疫沙漠型的對象中起作用［10］。

表1 不同腸道細菌對免疫治療的影響

2.1.1 腸道菌群和局部黏膜反應 腸道微生物群與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調節(jié)密切相關，特別與局部黏膜免疫有關。研究證明，相比正常小鼠，無菌小鼠的腸道黏膜變薄，腸系膜淋巴結變小且缺乏生發(fā)中心，淋巴濾泡缺乏，異常的高內皮小靜脈增生伴淋巴細胞結合不良［11-14］，這些因素導致無菌小鼠胃腸道黏膜免疫明顯缺陷。這些局部免疫缺陷還伴隨著CD4+淋巴細胞數(shù)量、漿細胞數(shù)量和IgA 生成的減少，導致腸道屏障功能進一步受損［15］。并且，這種缺陷的影響不局限在胃腸道，其進一步介導全身免疫機制異常，導致ICI治療失效。

目前主要有兩種理論解釋局部免疫系統(tǒng)介導全身免疫機制。一種是腸道微生物通過多種蛋白質和（或）代謝物調節(jié)免疫反應。特定的腸道菌群可通過發(fā)酵在結腸中產生多種代謝物。如短鏈脂肪酸、色氨酸、維生素A、維生素B12等，其在促進原始T 細胞分化，影響腸淋巴濾泡發(fā)生，維持正常淋巴細胞數(shù)量和NK細胞活性中起重要作用，是全身免疫環(huán)境發(fā)育和免疫細胞啟動的關鍵因素［16-19］。另外一種是共生細菌表達的抗原和腫瘤中發(fā)現(xiàn)的新表位之間的交叉反應［20］，這一機制尚待進一步探索，腸道菌群將有可能為腫瘤免疫治療提供更多的殺傷靶點。

2.1.2 腸道菌群和系統(tǒng)固有反應 系統(tǒng)固有免疫調節(jié)也受共生微生物群的影響。循環(huán)的細菌衍生分子，如脂多糖、肽聚糖或鞭毛蛋白，當由先天性免疫細胞上的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRS）識別時，其可以通過信號傳遞促進MyD88 依賴的途徑發(fā)出信號，增強全身先天免疫細胞的反應性［21］。Science評論性文章表明腸道微生物能通過局部侵犯而侵入器官并產生理想或不良的結果。細菌移位進入脾臟、淋巴結或腫瘤可能引發(fā)強烈的免疫反應，這或許有利于激活惰性的腫瘤免疫微環(huán)境，輔助ICI免疫治療。另外，系統(tǒng)適應性免疫也受到共生細菌的刺激，特別是遠處（非黏膜）淋巴組織的正常發(fā)育，如脾臟和外周淋巴結。有研究表明，無菌小鼠器官中B淋巴細胞濾泡和T淋巴細胞區(qū)發(fā)育不良，血清IgG水平較低，證實上述結論［22］。

綜上所述，腸道菌群可通過影響機體局部和（或）全身的免疫發(fā)育和調節(jié)，建立宏觀和（或）微觀的免疫環(huán)境，最終成為影響腫瘤ICI治療療效的重要因素。

2.2 腸道菌群與免疫治療生物標志物

隨著邏輯生物標志物PD-1/PD-L1地位的下降，為了提高ICI 療效，新興的標志物被相繼發(fā)掘，包括腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）、腫瘤特異性新抗原肽（tumor neoantigen burden，TNB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）、腫瘤浸潤微環(huán)境、腸道菌群等。腸道菌群可能與其他標志物間存在聯(lián)系。

2.2.1 腸道菌群和TMB、TNB TMB定義為腫瘤基因組去除胚系突變后的體細胞突變數(shù)量，一般以非同義突變總數(shù)量表示。許多小鼠或人類腫瘤免疫應答的靶點是TNB，這些新抗原肽是由腫瘤基因組的體細胞突變引起的，繼而產生特異性T細胞反應。一項研究納入64 例采用抗CTLA-4 抗體治療的惡性黑色素瘤患者，結果表明，長期受益的患者相比對照組具有特異性的體細胞新表位［23］。一項包括27種腫瘤類型的薈萃分析顯示平均反應率與TMB 呈正相關［24］。TMB 的實質是基因突變，突變基因產生的新生抗原在ICI治療中強化了腫瘤免疫識別。

腸道菌群可以損傷DNA，在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。雖然鮮見腸道菌群變化與TMB高低關系的直接研究，但根據(jù)其作用機制，可推斷腸道菌群與TMB間存在聯(lián)系。腸道微生物可通過直接或間接的方式損傷宿主DNA 或抑制其DNA 修復功能。產腸毒素脆弱類桿菌可激活Wnt/β-catenin 信號通路，從而引起腸上皮細胞DNA 損傷；PKS 陽性大腸埃希菌可編碼基因毒素，導致腸上皮內DNA雙鏈斷裂，通過破損-融合-交聯(lián)反應進一步導致染色體不穩(wěn)定性下降；革蘭陰性菌可以產生致死性腫脹毒素進入細胞核損傷DNA，同時阻礙修復過程；硫酸鹽還原菌還原食物中的硫酸根離子產生硫化氫，引起人腸上皮細胞產生劑量依賴的氧化性DNA損傷和斷裂。另外腸道細菌的代謝產物如次級膽汁酸、葡萄糖醛酸酶、亞硝基化合物等均有促進腸道炎癥的作用，導致基因突變幾率升高。理論上講，更多的基因突變，使高TMB 及高TNB 的機會也極大增加，但需要更多研究證實。多種腫瘤包括肺癌、胃癌、肝癌、血液腫瘤、黑色素瘤、泌尿系腫瘤中腸道菌群間存在差異，推測其機制：基本均存在炎癥及細菌代謝產物在其中的影響作用，其TMB 高低差異或許可用不同的腸道細菌解釋。

2.2.2 腸道菌群和MSI MSI-H 是指由于錯配修復基因受損（mismatch repair，MMR）而導致的體細胞突變在其區(qū)域內的高積累率，MMR是一個負責DNA損傷識別和修復的系統(tǒng)。從機制上講，MSI 腫瘤是高TMB 腫瘤的一種特殊類型，其由于高突變而產生大量新肽。2017年美國食品和藥物管理局（FDA）批準的3 種免疫治療方案均可用于轉移性MSI-H 大腸癌患者。并且nivolumab 和pembrolizumab 適用于MSIH 的任何腫瘤，這是基于Keynote 016、Checkmate 142的試驗結果，研究證實了15 種MSI 癌種對免疫治療的高敏感性［25-26］。MSI 已成為廣泛認可的免疫標志物。Tahara等［27］通過對149個結直腸癌組織、89個癌旁正常黏膜和72個來自無癌個體的結腸黏膜進行實時定量PCR，證實了癌組織中的細菌數(shù)量更多，表明高梭狀芽胞桿菌與MSI 之間存在相關性（P=0.018），在可獲得全外顯子組測序數(shù)據(jù)的11 例病例中，2 例為高梭狀芽胞桿菌的病例中具有最高的體細胞突變數(shù)量。這為腸道菌群與MSI 之間的關系提供了依據(jù)，同時再次提示了細菌與TMB 的可能聯(lián)系。隨后，在國外一項包括2 000余例的結直腸癌研究中證明了梭狀芽胞桿菌（F.nucleatum）與MSI 的關聯(lián)性，驗證了上述結論［28］。

腸道菌群和TMB、TNB及MSI之間的潛在聯(lián)系可能是影響ICI療效的潛在機制之一，大量的腫瘤新生抗原肽有助于增強微生物抗原與腫瘤抗原之間的模擬或交叉反應。因此聯(lián)合檢測腸道菌群與TMB、MSI可能是未來提高ICI有效率的方向之一。

3 腸道菌群和免疫相關不良事件

雖然免疫治療效果卓越，且不良反應通常比化療小，但其同樣可以發(fā)生嚴重的免疫相關不良事件（immune related adverse events，IRAEs），包括免疫相關性結腸炎、肝炎、間質性肺炎、甲狀腺炎、垂體炎等。近期研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群在出現(xiàn)免疫相關性結腸炎的患者中存在區(qū)別。Chaput 等［29］發(fā)現(xiàn)在抗CTLA-4治療的轉移性黑色素瘤患者隊列中，在未發(fā)生結腸炎的患者中觀察到高比例的類桿菌。同樣的，Dubin等［6］研究表明接受抗CTLA-4治療后發(fā)生結腸炎的類桿菌的數(shù)量明顯低于無結腸炎患者，提示類桿菌屬對ipilimumab 相關結腸炎具有保護作用。國內一項研究顯示重癥ICI 相關性結腸炎中乳酸桿菌的數(shù)量明顯減少，口服羅伊氏乳酸桿菌（L.Reuteri）可預防性抑制結腸炎的發(fā)生和發(fā)展，改善ICI治療引起的體重減輕和炎癥狀態(tài)［30］。通過腸道菌群干預IRAEs 的研究目前仍較少，進一步研究確定耐IRAEs患者的優(yōu)勢菌群是未來的研究方向。

4 腸道菌群干預療法對免疫治療的影響

目前，抗生素和糞便微生物群移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）是唯一經FDA批準的針對腸道微生物群的方法［31］。

4.1 抗生素

已經證實抗生素的使用可干預腸道菌群的組成成分，從而影響ICI療效。如當給小鼠注射萬古霉素時，CTLA-4 阻滯劑的效果增強［2］。但理論上抗生素的使用對ICI的影響尚存爭議，因為無法用抗生素準確控制腸道的“好菌群”和“壞菌群”。Routy等［3］通過對非小細胞肺癌、腎癌和尿路上皮癌患者應用抗PD-1和PD-L1治療的回顧性分析，發(fā)現(xiàn)治療前2 個月或治療后1 個月內使用抗生素的患者組無進展生存期和總生存期明顯短于未接受抗生素治療的相同腫瘤類型患者組。另有研究稱抗生素的使用與抗PD-1和抗CTLA-4 治療的荷瘤小鼠和轉移性結腸癌和非小細胞肺癌患者的預后較差相關［2，32］。然而，一項接受ipilimumab 治療的轉移性黑色素瘤患者前瞻性隊列和接受nivolumab治療的晚期非小細胞肺癌患者回顧性隊列研究表明，抗生素的使用對檢查點阻斷反應或潛在預測關聯(lián)沒有影響［29］。在多樣性方面同樣存在差異，與無應答者相比，對抗PD-1 治療有應答的黑色素瘤患者的腸道微生物組群具有更高的多樣性。一項單獨的黑色素瘤隊列研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1和抗CTLA-4 治療的應答者和非應答者的腸道微生物多樣性水平無顯著性差異［33］。結論的矛盾在各種癌種中均有體現(xiàn)。一項約200例多中心隊列研究表明，包括非小細胞肺癌、黑色素瘤在內的多個癌種，在免疫治療前1 個月接受過廣譜抗生素治療組與未使用抗生素組相比，總生存期減少13倍，而在免疫治療期間使用似乎無影響［34］。如何使用抗生素、何時使用、使用何種抗生素，如何構建有利的腸道菌群環(huán)境成為免疫治療未來研究的關鍵。

4.2 糞便微生物移植

FMT最早用在偽膜性腸炎治療，逐漸擴展至難辨梭狀芽孢桿菌感染、炎癥性腸病、過敏性胃腸病等多種腸源性疾病，總體上短期安全性較高。目前報道的研究，多基于動物模型間、人類向動物的糞便移植，表明糞便移植在動物模型的ICI療效干預上可行［1，5］，鮮見ICI患者間的糞便移植數(shù)據(jù)。FMT的有效性建立在整個腸道群落的替代基礎上，是一種“激進”的干預措施，可能會導致不可預測的結果，包括感染、腸道炎癥，免疫相關性疾病，并且在中國倫理學等問題尚面臨爭議。一項研究表明使用上消化道途徑導致不良事件發(fā)生率高于下消化道途徑（43.6%vs.17.7%）［35］。Imdad等［36］關于FMT療效安全性的系統(tǒng)評價報道，由于FMT的嚴重不良事件發(fā)生率低，但證據(jù)質量低，缺乏可靠的數(shù)據(jù)，因此尚無明確的結論。目前，研究仍停留在ICI有效人群糞便向小鼠移植恢復小鼠免疫應答，精準確定最有利的ICI有關菌群尚需要更多的探索，這也是未來腸道菌群成為免疫治療靶點的關鍵。

4.3 益生元、益生菌、合生元、后生素的使用

除了抗生素及糞便移植，口服益生元、益生菌、合生元及后生素是另一種干預腸道菌群的方法。益生元是不易消化的碳水化合物，通常包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和乳果糖，這些物質已被證明可增加健康人群中的共生乳酸桿菌和（或）雙歧桿菌［37］。益生菌被定義為對人體有利的活體微生物。合生元是益生菌及益生元的組合。臨床上廣泛使用益生菌調節(jié)腸道菌群，治療腹瀉、便秘、腹脹、消化不良等胃腸道癥狀。在免疫治療患者中，通過口服益生菌提高療效同樣需要準確的有利菌群理論的支持。有研究稱口服雙歧桿菌可增加CD8+腫瘤特異性T 細胞的腫瘤浸潤和IFN-γ的產生，并通過一種涉及增加脾臟和腫瘤內樹突狀細胞活化的機制改善基礎腫瘤控制和抗PD-L1的療效［1］。另外，盡管大量的研究表明口服對應腸道細菌提高ICI療效是成立的，但益生菌安全性的證據(jù)仍然不足。只有確定了各種臨床條件下最有益的微生物群組成，才有可能將微生物群組成用作生物標記物、診斷工具或治療靶點。后生素是細菌代謝的非活性產物（包括短鏈氨基酸、色氨酸、維生素等），以特定方式影響宿主的反應。

總的來說，干預腸道菌群進而調節(jié)免疫治療療效仍處于摸索階段。

5 結語

腸道菌群是重要的ICI標志物，但相關研究結果存在較多差異，需要進一步探索。目前在動物體內將共生細菌物種與ICI的抗癌作用聯(lián)系起來的機制尚不確定。進一步了解微生物群的免疫調節(jié)機制，標準化取樣、測序技術和數(shù)據(jù)分析，確保研究設計的一致性，探索其與已知生物標志物間可能的潛在聯(lián)系，是需要納入未來研究的關鍵考慮因素。

值得注意的是人類應答者的糞便移植可以包含多種微生物，并且檢查點抑制劑應答的機制可以是共同的。在未最終確定有利菌群的種類和數(shù)量前，益生菌等其他手段可能加重患者病情，干擾免疫治療。因此，在進行相應研究時，涉及接種單系細菌和在應答者中進行免疫分析時應該更加謹慎。