鞏笑笑，閆冰玉，譚玉榮，王 鵬，李雙江，王 藝，周璐瑤，劉進(jìn)平

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， ?？?570228)

橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)作為最主要的產(chǎn)膠植物已在我國(guó)海南、云南、廣東、廣西及福建等地區(qū)廣泛種植。天然橡膠因其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及國(guó)防領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，已成為不可或缺的工業(yè)原料及戰(zhàn)略物資[1-4]。目前，天然橡膠的生物合成已取得較大進(jìn)展，但是橡膠生物合成的調(diào)控機(jī)制研究仍然很少[5]。天然橡膠是以異戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)作為單體聚合形成的聚異戊二烯(cis-1,4,-polyisoprene)[6]。目前認(rèn)為，在高等植物中IPP通過(guò)甲羥戊酸(mevalonic acid,MVA)及甲基赤蘚醇四磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)2條途徑合成，但早期放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明，天然橡膠生物合成的前體IPP來(lái)源于MVA途徑[7]。其中，羥甲基戊二酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylgutaryl-CoA synthase,HMGS)是橡膠樹(shù)中參與橡膠生物合成及MVA途徑中其他類(lèi)異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶[8]，橡膠樹(shù)中編碼該酶的基因已被克隆，SUWANMANEE等[9]與SIRINUPONG等[10]先后克隆了該基因家族的2個(gè)成員hmgs1和hmgs2，且hmgs1在乳膠細(xì)胞的表達(dá)量要比葉片中高，hmgs2在乳膠、葉柄及葉片中的mRNA表達(dá)量各不同，其中，乳膠中的表達(dá)量最高，葉柄次之，葉片中最低。研究表明，HbHMGS基因的cDNA序列與擬南芥和樟子松的cDNA序列相似性分別達(dá)到了81%及74%[9]。目前已有研究表明，乙烯利刺激橡膠樹(shù)后能夠顯著增加HbHMGS的酶活性[11]，但是尚未見(jiàn)光照、干旱和熱擊等環(huán)境因素對(duì)該基因表達(dá)調(diào)控的報(bào)道。啟動(dòng)子是基因編碼區(qū)上游與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一段非編碼DNA序列，并且在基因表達(dá)與調(diào)控方面起到重要作用[12]。植物啟動(dòng)子根據(jù)基因表達(dá)調(diào)控類(lèi)型不同可以分為組成型、誘導(dǎo)性及組織特異型啟動(dòng)子幾種類(lèi)型[13]。目前，花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子和nos(胭脂堿合酶)啟動(dòng)子[14]是應(yīng)用比較廣泛的組成型啟動(dòng)子[15]，它能在雙子葉轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)[16]。由于啟動(dòng)子在表達(dá)調(diào)控方面的重要作用，筆者克隆了橡膠樹(shù)HbHMGS1基因啟動(dòng)子，并構(gòu)建與GUS基因融合的植物表達(dá)缺失載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥進(jìn)行表達(dá)分析，確定了HbHMGS1啟動(dòng)子在T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的組織特異性及對(duì)光照、干旱及熱擊等處理響應(yīng)表達(dá)情況，旨在了解HbHMGS1基因表達(dá)模式及其在橡膠生物合成與對(duì)非生物脅迫響應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1材料本實(shí)驗(yàn)所用的橡膠樹(shù)葉片取自海南大學(xué)試驗(yàn)基地?zé)嵫?-33-97品系嫁接植株。野生型擬南芥種子哥倫比亞型(col-0)及煙草種子(本生煙)，植物表達(dá)載體pCAMBIA1301，農(nóng)桿菌菌株GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存；LA Taq DNA polymerase(TaKaRa, RR02MB )，限制性?xún)?nèi)切酶(TaKaRa)，T4DNA連接酶(TaKaRa)均購(gòu)自大連寶生物公司；質(zhì)粒DNA提取(OMEGA，D6943-02)和膠回收試劑盒(OMEGA，D2500-02)購(gòu)自北京智遠(yuǎn)方杰有限公司；生化試劑購(gòu)自上海生工，Marker，抗生素及19T載體購(gòu)自大連寶生物公司。引物合成和基因測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。GUS染液配置：2 mmol·L-1X-GLuc,100 mmol·L-1Na3PO4緩沖液，5 mmol·L-1K3Fe(CN)6,5 mmol·L-1K4Fe(CN)6，10 mmol·L-1EDTA, 0.2% Triton X-100。

植物材料的處理：(1)光照處理：選取2組長(zhǎng)勢(shì)基本一致且健康的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，分別置于持續(xù)光照和黑暗條件下進(jìn)行處理，分別在處理12，24，48，72，96，120和144 h后進(jìn)行取樣。(2)熱擊與干旱處理：將2組含有6個(gè)缺失片段的轉(zhuǎn)基因苗1組放置在37 ℃培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)中進(jìn)行熱擊處理5 h后取樣，另外1組置于原來(lái)環(huán)境中停澆水約10 d后進(jìn)行取樣，各缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥苗作為對(duì)照不進(jìn)行任何處理。含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同時(shí)進(jìn)行以上處理。

1.2HbHMGS1啟動(dòng)子克隆及缺失表達(dá)載體的構(gòu)建以橡膠樹(shù)葉片為主要材料，采用CTAB法提取基因組DNA。下載NCBI上已發(fā)布的橡膠樹(shù)HbHMGS1基因mRNA序列(GenBank Accession number:AF396829)和橡膠樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[17]進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取HbHMGS1啟動(dòng)子序列。利用Primerpremier5軟件設(shè)計(jì)正向引物HbHMGSP-F：CGggatccGCAAACAAGAGGAATGGTTG 及反向引物HbHMGSP-R： CATGccatggTCTCTACGCCTCTCCAATTCC擴(kuò)增HbHMGS1基因起始密碼子ATG上游1 656 bp的序列，在基因的上下游引物中分別引入了BamHI和NcoI酶切位點(diǎn)，進(jìn)一步構(gòu)建T載體送測(cè)序。以驗(yàn)證正確的包含HbHMGS1啟動(dòng)子質(zhì)粒DNA為模板，分別在HbHMGS1啟動(dòng)子上游-1290/-1、-1040/-1、-699/-1、-454/-1及-213/-1(ATG)處設(shè)計(jì)5′缺失特異性引物作為上游引物，反向引物不變，通過(guò)PCR擴(kuò)增HbHMGS1啟動(dòng)子5′側(cè)翼序列各缺失片段。引物序列分別是，D2-cF(-1290/-1)：CGggatccTCCTTAAATTTAAGAGTTTAACGAG；D3-cF(-1040/-1)：CGggatccTGGATGGCTTCTGATTTGGT；D4-cF(-699/-1)：CGggatccGATTCGTGTCGCATGAGGTT；D5-cF(-454/-1)：CGggatccGAAGTGGGCTCCAAAAGATT和D6-cF(-213/-1)：CGggatccTTCTCTCCTTGCTGCTTCCA。PCR產(chǎn)物膠回收后，連接T載經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后測(cè)序驗(yàn)證。將攜帶HbHMGS1啟動(dòng)子5′各缺失片段的T載體用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和NcoI進(jìn)行雙酶切，同時(shí)用這2個(gè)酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建各缺失片段與GUS基因的融合表達(dá)載體，各構(gòu)建載體分別命名為D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213。

1.3生物信息學(xué)分析將克隆獲得的HbHMGS1啟動(dòng)子序列，通過(guò)DNAMAN的生物信息分析軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用PlantCARE[18](http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，以期對(duì)HbHMGS1啟動(dòng)子的功能進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)。

1.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的HbHMGS1啟動(dòng)子各缺失片段與GUS融合的植物表達(dá)載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌菌株中，取適量的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液體培養(yǎng)基中，至OD600值為1.5～2.0，用10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES(pH5.7)和400 μmol·L-1AS(乙酰丁香酮)的無(wú)菌溶液懸浮，調(diào)整菌液濃度使其OD600值約為2.0，室溫靜置3 h后用無(wú)針頭的注射器將懸浮液注射到生長(zhǎng)1月左右的煙草葉片背面，28 ℃培養(yǎng)3 d，然后用打孔器取葉片進(jìn)行GUS染色。

1.5擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定將前期保存的HbHMGS1啟動(dòng)子及其缺失啟動(dòng)子菌液擴(kuò)大培養(yǎng)到100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0～1.3；5 000 r·min-1離心10 min后收集農(nóng)桿菌細(xì)胞；配置w=5%蔗糖的侵染液溶解農(nóng)桿菌沉淀，并調(diào)整OD600≈1.0，轉(zhuǎn)化前加φ=0.02%的Silwet L-77，采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。剪去長(zhǎng)勢(shì)較好的野生型擬南芥植株的果夾，將未授粉的花序浸沒(méi)在侵染液中約90 s。待植株成熟后收取T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用φ=70%酒精及w=10%次氯酸鈉進(jìn)行殺菌，最后將種子均勻平鋪在含有50 g·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。將轉(zhuǎn)入HbHMGS1啟動(dòng)子及其他缺失片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代種子經(jīng)潮霉素抗性板篩選后，待其成熟進(jìn)一步提取T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的DNA，以DNA為模板使用特異性引物和GUS引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.6組織化學(xué)染色及GUS活性熒光檢測(cè)取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗不同時(shí)期和成熟階段各組織器官進(jìn)行GUS染色，以X-Gluc為底物，GUS染液浸沒(méi)材料即可，37 ℃過(guò)夜，用70%乙醇脫色后，觀察染色結(jié)果并拍照。GUS活性的定量分析利用4-MUG作為底物[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1HbHMGS1啟動(dòng)子和其缺失片段克隆以及植物表達(dá)載體的構(gòu)建橡膠樹(shù)HbHMGS1啟動(dòng)子及5'缺失片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，分別在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp處可見(jiàn)特異性單一的條帶，與預(yù)期目的條帶大小相似(圖1A)。進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)物膠回收，連接pMD19T載體后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致。將以上測(cè)序驗(yàn)證正確的包含HbHMGS1啟動(dòng)子及5′各缺失片段的T載體酶切后進(jìn)一步構(gòu)建與GUS基因的融合植物表達(dá)載體。對(duì)目的表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1B所示，分別在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp處各切出一條單一的條帶，這些條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)后，序列正確。結(jié)果表明HbHMGS1啟動(dòng)子和其5'缺失片段與GUS基因融合的植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2HbHMGS1啟動(dòng)子序列特征分析將克隆獲得的HbHMGS1啟動(dòng)子序列，通過(guò)PlantCARE在線軟件分析，預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2)表明，HbHMGS1啟動(dòng)子含有TATA-box、CAAT-box等基本順式作用元件以及多種調(diào)控元件，如4個(gè)光反應(yīng)相關(guān)元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif、1個(gè)乙烯響應(yīng)元件ERE、1個(gè)赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif、2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif、1個(gè)熱脅迫相關(guān)元件HSE及1個(gè)干旱響應(yīng)元件MBS等其他重要作用元件。

圖2 橡膠樹(shù)HbHMGS1啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.3煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)分析筆者將構(gòu)建好的6個(gè)與GUS基因融合的表達(dá)載體D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213和陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1301通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)化到煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。取包含每個(gè)缺失片段的煙草葉片進(jìn)行GUS染色，結(jié)果顯示，缺失片段D1-1656、D2-1290、D3-1040、D4-699及D5-454都能夠啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，葉片染色顯藍(lán)色，但是D6-213缺失啟動(dòng)子卻不能夠啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，GUS染色沒(méi)有呈現(xiàn)藍(lán)色，這一結(jié)果可能是因?yàn)榫郃TG上游的213 bp(-213/-1)缺少了轉(zhuǎn)錄起始或翻譯必須的順式作用元件，導(dǎo)致下游GUS蛋白不能夠正常表達(dá)，且35S啟動(dòng)子能夠正常啟動(dòng)GUS蛋白表達(dá)，GUS染色顯藍(lán)色(圖4)，說(shuō)明HbHMGS1啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性。

2.4HbHMGS1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的功能分析

2.4.1 HbHMGS1啟動(dòng)子組織特異性分析按照上述方法將構(gòu)建好的HbHMGS1啟動(dòng)子與GUS融合的植物表達(dá)載體通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將檢測(cè)為陽(yáng)性植株的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行GUS染色，獲得了9株T1代株系，隨機(jī)挑選2個(gè)株系進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，分別選取了種子春化后生長(zhǎng)6，12和17 d的幼苗，45 d成熟植株的根、莖、葉、花絮、果莢，以及17 d的35S驅(qū)動(dòng)GUS轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥進(jìn)行GUS染色，染色結(jié)果表明，HbHMGS1啟動(dòng)子能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的幼苗及成熟苗的各個(gè)組織中啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，且染色后呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色也很明顯，但是野生型擬南芥顯示GUS基因沒(méi)有表達(dá)(圖5)。

2.4.2 HbHMGS1啟動(dòng)子光照處理GUS活性表達(dá)分析筆者將2組含有HbHMGS1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同時(shí)進(jìn)行光照及黑暗處理后進(jìn)行取樣提蛋白測(cè)其酶活。結(jié)果顯示：在持續(xù)光照條件下，光照24，48，72 h后，GUS蛋白活性逐漸上升，且光照處理96 h后，GUS活性增大到處理72 h的3.2倍，但是在處理120 h后，GUS活性下降到原來(lái)水平，隨后保持平穩(wěn)(圖6)。持續(xù)黑暗處理轉(zhuǎn)基因擬南芥苗后，黑暗處理12 h～48 h后，葉片GUS活性檢測(cè)持續(xù)上升，在繼續(xù)處理72，96 h后葉片GUS活性顯著增加，且分別是處理48 h時(shí)GUS活性的1.38倍和2.13倍，但是在黑暗處理120 h后GUS活性沒(méi)有繼續(xù)顯著上升，與處理96 h后GUS活性相近(圖6)。

2.4.3 HbHMGS1啟動(dòng)子及其缺失片段響應(yīng)熱擊和干旱處理表達(dá)分析熱擊(37 ℃)脅迫時(shí)，如圖7A所示，D4-699、D5-454和D6-213缺失片段GUS活性都有明顯的增強(qiáng)，且分別是未處理之前的1.40倍，1.54倍及1.94倍 ，表明-699到起始密碼子-1處的這一段序列中可能存在數(shù)個(gè)響應(yīng)熱擊處理的元件，且-1656到-699這一區(qū)域在響應(yīng)熱擊處理后可能抑制了GUS基因的表達(dá)(圖7A)。干旱脅迫時(shí)，如圖7B所示，HbHMGS1啟動(dòng)子及其各缺失片段GUS活性檢測(cè)基本有下降，但D6-213缺失片段GUS活性增加了1.63倍(圖7B)。以上數(shù)據(jù)表明：HbHMGS1啟動(dòng)子響應(yīng)熱擊區(qū)域可能主要集中在距起始密碼子-1到上游-699這一段序列中；干旱響應(yīng)區(qū)域則則主要位于-213到起始密碼子-1(ATG)處的213bp序列中。

3 討 論

本研究以GUS基因作為報(bào)告基因，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥實(shí)驗(yàn)分析HbHMGS1 基因5′上游啟動(dòng)子序列的啟動(dòng)活性，PlantCARE在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HbHMGS1啟動(dòng)子包含多種調(diào)控元件，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HbHMGS1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥的幼苗時(shí)期及成熟時(shí)期的各組織器官中都有啟動(dòng)活性，其他研究發(fā)現(xiàn)芥菜中HMGS基因也可以在植株所有器官中表達(dá)[21]。 以上這一結(jié)果可能是因?yàn)轭?lèi)異戊二烯是植物中分布廣泛的代謝物，且參與多種重要的生理過(guò)程，而HMGS基因?qū)τ谏a(chǎn)各種類(lèi)異戊二烯化合物起到至關(guān)重要的作用[22,23]，因此，HbHMGS1啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的各個(gè)組織器官中表達(dá)。

PlantCARE在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HbHMGS1啟動(dòng)子有4個(gè)光響應(yīng)相關(guān)元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif，且分布在該啟動(dòng)子序列的多個(gè)部位。因此，本研究對(duì)包含HbHMGS1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行了光照和黑暗處理，在光照處理96 h左右，GUS活性瞬間增大后又降低到原來(lái)水平，同樣在黑暗處理下，GUS活性逐漸上升且在96h左右明顯增加，但與光照條件下不同的是，GUS活性并沒(méi)有急劇下降而是持續(xù)增大該結(jié)果表明，HbHMGS1啟動(dòng)子可能同時(shí)受光照和黑暗影響。本研究對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株熱擊處理后，發(fā)現(xiàn)缺失啟動(dòng)子D4-699、D5-454及D6-213和對(duì)照相比GUS活性上升，D1-1656、D2-1290及D3-1040 GUS活性則下降，結(jié)果表明，-699到-1和-1656到-699分別存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的熱擊信號(hào)。啟動(dòng)子在線作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，-1656/-1290、-1290/-1040、-1040/-699及-213/-1幾個(gè)區(qū)域均存在熱擊響應(yīng)元件HSE(AAAAAATTTC)，但是定量GUS活性檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，存在熱擊響應(yīng)元件HSE的幾個(gè)缺失啟動(dòng)子正負(fù)調(diào)控并不一致。預(yù)測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HbHMGS1啟動(dòng)子中包含有干旱誘導(dǎo)的響應(yīng)元件MBS，分別位于-1656到-1290和-454到-213這兩個(gè)區(qū)域，但是，經(jīng)干旱處理各缺失啟動(dòng)子后，GUS活性除D6-213缺失啟動(dòng)子外均表現(xiàn)下降，MBS干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件可能在負(fù)調(diào)控方面起到重要作用，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。