余厚美，張振文

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所/國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心/農(nóng)業(yè)部木薯種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室，海南 儋州 571737)

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)是一種水解酶，也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龍膽二糖酶[1]，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[2]，相對分子質(zhì)量一般在40×103～250×103之間。1837 年， LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶，其廣泛存在于許多古細菌、細菌、真菌、酵母、曲霉、昆蟲、動物和植物中[3-5]。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子質(zhì)量差異較大，這是由其結(jié)構(gòu)和組成的不同導致的。由于參與生物體的糖代謝，β-葡萄糖苷酶對維持生物體的正常生理功能有著重要作用[2]，已經(jīng)在哺乳動物的疾病防治和人類的癌癥治療方面廣泛開展了應(yīng)用研究[2,6]；此外，β-葡萄糖苷酶還能將果、蔬、茶中的風味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風味的香氣物質(zhì)，協(xié)助纖維素酶降解纖維素等功能[1-2,7-8]，在飼料工業(yè)、生物合成和生物燃料等領(lǐng)域，β-葡萄糖苷酶同樣有巨大的應(yīng)用價值[4,9]。目前，β-葡萄糖苷酶的檢測技術(shù)主要是酶活法，主要測試方法有分光光度法、熒光法、電化法和比色法[8]和以京尼平苷為底物檢測酶活的一種新方法[10]。分光光度法容易受到干擾，靈敏度低；熒光法靈敏度高，但是操作復雜，重復性差[11]。比色法雖然靈敏度不如以京尼平苷為底物的方法高，但是總體來說，簡單、快速、重復性好[8，11]。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是免疫學領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，是將免疫學技術(shù)與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的檢測技術(shù)。ELISA的優(yōu)點是檢測成本低、可大批量檢測、專一性強、靈敏度高、安全性好，可進行定性或者定量檢測，不需要昂貴的儀器，操作簡單，容易推廣普及，尤其適合樣本量大、檢測種類多的現(xiàn)場和基層檢測[12-14]。免疫學分析技術(shù)主要利用抗原抗體的特異性結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于生命科學的各個研究領(lǐng)域。近年來免疫學分析技術(shù)以其抗原抗體反應(yīng)的高度專一性和特異性，在人類臨床診斷、食品安全等領(lǐng)域 廣泛應(yīng)用[15]。

1 材料與方法

1.1實驗材料以β-葡萄糖苷酶為抗原，該抗原分別購自北京索萊寶公司、上海源葉生物公司、上海麥克林公司(表1)；DMEM不完全培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司； HAT、HT、DMSO、小鼠抗體亞型鑒定試劑盒、鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)為Sigma公司產(chǎn)品；QuickAntibody-mouse 5w佐劑、clone easy培養(yǎng)基購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；弗氏佐劑、HRP-羊抗鼠、PEG融合劑、TMB底物液、封閉液和抗體稀釋液購自海南億康生物科技有限公司；胎牛血清、小牛血清購自蘭州民海生物公司；Tween-20、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀和甘油等化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司； Babl/C小鼠購自汕頭大學醫(yī)學中心；SP2/0保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所國家薯類加工技術(shù)研發(fā)分中心實驗室。

表1 不同廠家的抗原信息

1.2動物免疫將不同廠商生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶分別編號為A，B，C， 按每鼠50 μg的劑量與QuickAntibody-mouse 5w佐劑等劑量混勻，后腿肌肉注射免疫4只小鼠，第21 天按同樣方式再免疫 1 次，第35 天斷尾采血，全血37 ℃ 放置 2 h后4 ℃ 放置12 h，4 ℃ 10 000 r·min-1離心15 min，收集血清，每只小鼠血清都用A，B，C 3種蛋白作為包被原，ELISA間接法檢測血清效價。

1.3單克隆抗體的制備取50 g 免疫原用生理鹽水定容到500 μL，腹腔沖擊免疫抗體效價高的小鼠，沖擊免疫后72 h 左右摘眼球取全血分離血清保存，備用。將小鼠在體積分數(shù)為75%的酒精中浸泡10 min，無菌條件下取出小鼠脾臟并分離脾細胞，與 SP2/0 細胞在 PEG 作用下融合，HAT 篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)7～10 d ，以免疫原為包被原，用上述間接ELISA 檢測細胞上清，陽性細胞用有限稀釋法克隆直至陽性單克隆率為 100%，小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，將陽性雜交瘤細胞于液氮中長期保存[13]。

1.4腹水純化參考歐文軍等方法[15]并加以改進，將新采集的腹水于4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，去沉淀，用0.05 mol·L-1、pH7.0的PBS 5倍稀釋，在冰浴條件下等體積逐滴加入飽和硫酸銨溶液，冰浴攪拌30 min后4 ℃靜置12 h，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用與腹水等體積的0.02 mol·L-1、 pH 7.2 的PBS溶解，冰浴條件下再逐滴加入總PBS體積半量的飽和硫酸銨溶液使之達到33%飽和度，連續(xù)攪拌30 min后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀用0.02 mol·L-1、pH 7.2 的PBS透析72 h后分裝，- 20 ℃凍存。每個抗體純化前后各取10 μL，用SDS-PAGE對抗體進行電泳，考馬斯亮藍染色檢測純化效果。

1.5抗體效價和特異性檢測采用棋盤法測定抗體效價，即抗原用pH 9.6，0.05 mol·L-1的碳酸鹽緩沖液稀釋，按照100 ng·mL-1，200 ng·mL-1，500 ng·mL-1，1 μg·mL-1，2 μg·mL-1，5 μg·mL-1的濃度梯度包被于酶標板，每孔100 μL，37 ℃ 包被2 h，PBST 洗滌1次，每孔用120 μL含5% 小牛血清的PBST，37 ℃封閉1.5 h，每孔加100 μL梯度稀釋的抗體，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST洗滌 4～5 次，每孔加100 μL酶標羊抗鼠二抗，37 ℃反應(yīng)30 min，PBST 洗滌4～5 次，TMB底物液37 ℃顯色反應(yīng)15 min，0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)后，酶標儀450 nm波長處檢測每孔的吸光度值。選擇陽性孔OD值大于陰性O(shè)D值的2.1倍的抗體最高稀釋倍數(shù)為抗體的效價。然后分別在酶標板上包被1 μg·mL-1Aβ-葡萄糖苷酶、Bβ-葡萄糖苷酶、Cβ-葡萄糖苷酶、KLH、BSA，采用ELISA方法檢測抗體的特異性。

1.6抗體亞型鑒定用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒檢測單抗的亞型。

1.7電泳鑒定3種β-葡萄糖苷酶抗原分別取20 μg ABC 3種抗原，用SDS-PAGE對抗原進行電泳，考馬斯亮藍染色。

2 結(jié)果與分析

2.1抗原SDS-PAGE鑒定抗原相對分子質(zhì)量大小對免疫結(jié)果至關(guān)重要。本研究將3種抗原進行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，3種抗原電泳條帶差異明顯。A、B抗原在250×103附近有條帶出現(xiàn)，但是出現(xiàn)位置不同，C抗原在該區(qū)域沒有條帶出現(xiàn)；3個抗原在95×103附近都有條帶出現(xiàn)，但是出現(xiàn)位置幾乎不重復，B抗原在95×103附近只有1條帶，A、C抗原均有2條帶；B、C抗原在55×103～72×103間有1個比較粗的蛋白條帶出現(xiàn)。在所有蛋白里面， B抗原條帶最多。

表2 小鼠血清效價檢測

2.2小鼠血清效價檢測用免疫前的小鼠血清作為陰性對照，抗原包被5 μg·mL-1，12只小鼠血清分別梯度稀釋，得到的血清效價見表2。A免疫原免疫的小鼠只對A抗原顯色，對B，C抗原不顯色，B和C免疫的小鼠也出現(xiàn)和A抗原免疫的小鼠一樣的情況，即只對本身免疫原顯色，對其余抗原均不顯色。挑選A抗原效價高的2#小鼠進行細胞融合。

2.3抗體純化前后效價測定和SDS-PAGE對比融合共鋪板8塊96孔板，融合細胞孔陽性率為1%，融合后的雜交瘤細胞經(jīng)過3次的有限稀釋克隆，得到5株陽性單克隆細胞。5株陽性單克隆細胞體外誘導法制備的腹水的效價均達到105及以上，結(jié)果見表3。純化前后進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2，純化后的抗體條帶主要集中在25×103和55×103附近，純化后雜質(zhì)明顯少于純化前，效價有所下降，但是變化不大，說明抗體純化保留了抗體的有效成分，成功去除了雜質(zhì)，達到了純化的目的。

2.4抗體純化后亞型測定和特異性測定將所有純化的抗體加入事先包被好的β-葡萄糖苷酶A 抗原、B 抗原、C 抗原、KLH、BSA板孔檢測抗體的特異性，結(jié)果(表4)表明，所有抗體均與B 抗原、C 抗原、KLH、BSA無交叉反應(yīng)，說明抗體均為A 抗原特異性抗體。通過抗原抗體特異性結(jié)合把抗體固定在酶標板上，加亞型抗體測定的單克隆抗體亞型均為IgG1型。

表 3 腹水純化前后效價檢測

表 4 純化后抗體特異性和抗體亞型測定

3 討 論

抗原抗體反應(yīng)是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)[16]，抗體是免疫分析技術(shù)的核心試劑[18]。機體產(chǎn)生抗體的強度，受到動物物種、年齡、體質(zhì)狀況、免疫部位、抗原結(jié)構(gòu)、抗原性質(zhì)、抗原劑量、佐劑、免疫途徑、間隔時間等因素的影響[18]。本研究使用的小鼠年齡、注射方式、注射劑量、免疫部位等完全一樣的情況下，所用的3 個β-葡萄糖苷酶均標注來自于杏仁，分別免疫后的抗體只對相應(yīng)原免疫原顯色，對其不同來源免疫源都不顯色。即A免疫的小鼠所得血清，只對A抗原顯色，對B、C抗原均不顯色；B免疫原和C免疫原免疫動物檢測結(jié)果A相同，都只對免疫原顯色，對其余抗原均不顯色。首先驗證是不是抗原活性原因引起的差異，所以要求廠商分別做質(zhì)控，但是反饋質(zhì)控活性正常；又分別購買同一生產(chǎn)廠商其他貨號的產(chǎn)品，檢測所得的結(jié)果和免疫原相似，即同一廠商的不同貨號和批次的蛋白均對從該廠商采購的β-葡萄糖苷酶為免疫原免疫的鼠產(chǎn)生的抗體顯色，對其余抗體不顯色，即A免疫的小鼠所得血清，只對A廠商來源的抗原顯色，對B、C抗原均不顯色，只是不同批次和貨號間效價有差異；B和C免疫后也得到相同的結(jié)果。本研究中，3個不同來源抗原經(jīng)電泳分析表明其相對分子質(zhì)量差別較大，A和B、C抗原條帶幾乎沒有重疊，所以產(chǎn)生的抗體間無交叉反應(yīng)，B、C抗原在55×103～72×103間有2個相似的條帶，但是B、C抗原免疫動物后，抗體檢測結(jié)果表明抗原間仍然沒有交叉反應(yīng)?？梢?，不同來源的抗原均產(chǎn)生了特異性抗體。β-葡萄糖苷酶免疫小鼠產(chǎn)生抗體差異如此大，可能是跟β-葡萄糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，因為不同來源(即使是同一菌屬的不同菌株或者同一植物組織)的β-葡萄糖苷酶的相對分子質(zhì)量差異40×103～250×103的范圍[2]，而且有單亞基、多亞基的區(qū)別，其結(jié)構(gòu)差異就有可能大相徑庭[19]。

不同的結(jié)構(gòu)有不同的空間構(gòu)象，抗體的產(chǎn)生是抗原刺激機體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，不同構(gòu)象的抗原免疫，肯定得到不同的抗體，這也是不同廠商來源的β-葡萄糖苷酶差異巨大的原因之一。此外，有研究表明，不同來源(化學合成、不同克隆表達產(chǎn)物、自然感染表達等)的同一生物分子的抗原存在差異，抗原中單個氨基酸替代突變所致抗原性的序貫漂移和抗原不穩(wěn)定等因素都對抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生很大的影響[20]。甚至在僅有一個氨基酸差異或僅為幾個小分子DNP的情況下，也會出現(xiàn)與抗體結(jié)合的情況，使之能逃避宿主的免疫應(yīng)答、抗體效價相差巨大的情況出現(xiàn)[16，21]。為此，避免因抗原來源不同導致產(chǎn)生特異性抗體，開展同一來源的抗體制備是解決出現(xiàn)特異性抗體的關(guān)鍵，也是今后研究的重點。