申倩倩，王 曉，鄧巧子，王 焱

(1.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 洛陽 471003)

宮頸癌是常見的婦科腫瘤，發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第2位，居女性生殖器官惡性腫瘤之首，其病理學(xué)分型以鱗狀細(xì)胞癌為主，占80%～85%[1-2]。由于宮頸鱗狀細(xì)胞癌早期缺乏明顯癥狀，早期診斷及預(yù)后評(píng)估不盡人意。有研究發(fā)現(xiàn)，受體酪氨酸激酶-絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(receptor tyrosine kinases-Ras GTPase-mitogen activated protein kinase，RTK-RAS-MAPK)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)，Raf是該通路的上游因子，其激活或突變可改變細(xì)胞周期，引起細(xì)胞永生化，促使腫瘤發(fā)生[3]；Spry是該通路的抑制因子，可抑制細(xì)胞的分化、表達(dá)及腫瘤的發(fā)生[4]。本研究通過檢測不同宮頸組織中Raf、Spry蛋白的表達(dá)情況，分析Raf、Spry在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為宮頸癌的早期診斷與預(yù)后評(píng)估提供線索。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2013年1月至2015年12月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并于病理科保存的宮頸組織石蠟切塊133例，患者年齡22～70(48.9±11.5)歲；宮頸鱗狀細(xì)胞癌50例，高度上皮內(nèi)病變32例，低度上皮內(nèi)病變22例，正常宮頸組織29例；所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診，術(shù)前未進(jìn)行任何治療，且臨床資料完整。

1.2主要試劑與儀器兔抗人Raf抗體(英國Abcam公司)，兔抗人Spry抗體(美國Proteintech公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)；切片機(jī)(德國LEICA公司)，離心機(jī)(美國Beckman公司)，烘烤箱(德國Herasafe公司)。

1.3免疫組織化學(xué)法檢測不同宮頸組織中Raf和Spry蛋白表達(dá)取宮頸組織蠟塊切片，脫蠟，水化，高壓修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫酶室溫孵育 10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，加一抗，4 ℃過夜孵育(Raf抗體工作濃度為1150，Spry抗體工作濃度為150)，次日取出，滴加二抗羊抗兔多克隆抗體孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)志鏈霉卵白素工作液孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠固定封片，顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定Raf與Spry蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)呈棕褐色、棕黃色或黃色顆粒，由2位專業(yè)的病理科醫(yī)師采用盲審法進(jìn)行閱片，依據(jù)組織中出現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分未達(dá)到一致者由第3位病理學(xué)專家重新評(píng)估。染色強(qiáng)度：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深黃色或褐色為3分。陽性細(xì)胞的百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。最后將染色強(qiáng)度得分和陽性細(xì)胞百分比得分相乘作為最終評(píng)分，≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同宮頸組織中Raf和Spry蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1、圖2和表1。Raf蛋白在正常宮頸組織、低度上皮內(nèi)病變組織、高度上皮內(nèi)病變組織、鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢，Spry蛋白在上述宮頸組織中的陽性表達(dá)率呈逐漸降低趨勢，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：正常宮頸組織；B：低度上皮內(nèi)病變組織；C：高度上皮內(nèi)病變組織；D：宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織。

圖1不同宮頸組織中Raf蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

Fig.1ExpressionofRafproteinindifferentcervicaltissues(immunohistochemistry，×200)

A：正常宮頸組織；B：低度上皮內(nèi)病變組織；C：高度上皮內(nèi)病變組織；D：宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織。

圖2不同宮頸組織中Spry蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

Fig.2ExpressionofSpryproteinindifferentcervicaltissues(immunohistochemistry，×200)

表1不同宮頸組織中Raf、Spry蛋白表達(dá)

Tab.1ExpressionofRafandSpryproteinsindifferentcervicaltissues

宮頸組織nRaf蛋白 陽性/例(%) 陰性/例(%) Spry蛋白 陽性/例(%) 陰性/例(%) 正常宮頸組織292(6.89)27(93.11)28(96.55)1(3.45)低度上皮內(nèi)病變組織227(31.82)a15(68.18)16(72.73)a6(27.27)高度上皮內(nèi)病變組織3220(62.50)ab12(37.50)13(40.63)ab19(59.37)鱗狀細(xì)胞癌組織5044(88.00)abc6(12.00)9(18.00)abc41(82.00)

注：與正常宮頸組織比較aP<0.05；與低度上皮內(nèi)病變組織比較bP<0.05；與高度上皮內(nèi)病變組織比較cP<0.05。

2.2Raf和Spry蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。Raf蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、病理分級(jí)無關(guān)(P>0.05)；Spry蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的病理分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。

表2Raf、Spry蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweenRafandSpryproteinexpressionandclinicopathologicalfeaturesofcervicalsquamouscellcarcinoma

臨床特征nRaf蛋白表達(dá)陽性/例(%)陰性/例(%)χ2PSpry蛋白表達(dá)陽性/例(%)陰性/例(%)χ2P年齡 <50歲2724(88.89)3(11.11)0.0440.8346(22.22)21(77.78)0.7090.400 ≥50歲2320(86.96)3(13.04)3(13.04)20(86.96)病理分級(jí) 高分化2925(86.21)4(13.79)0.2100.0648(27.59)21(72.41)4.2990.038 中-低分化2119(90.48)2(9.52)1(4.76)20(95.24)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無2217(77.27)5(22.73)4.4790.0345(22.73)17(77.27)0.5950.441 有2827(96.43)1(35.71)4(14.29)24(85.71)臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期3125(80.65)6(19.35)4.1790.0415(16.13)26(83.87)0.1930.660 Ⅲ～Ⅳ期1919(100.00)0(0.00)4(21.05)15(78.85)

2.3宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Raf與Spry蛋白表達(dá)的相關(guān)性宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Raf與Spry蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.460，P<0.05)。

3 討論

Raf具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，分為A-Raf、B-Raf、C-Raf，共包含3個(gè)保守區(qū)域，相互連接發(fā)揮作用[5]。Raf與p21-活化激酶、絲氨酸蛋白酶等結(jié)合發(fā)生磷酸化反應(yīng)而被激活，經(jīng)一系列相關(guān)激酶活化，啟動(dòng)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)控靶細(xì)胞的功能，引起腫瘤的發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Raf基因突變與甲狀腺癌[7]、結(jié)腸癌[8]、卵巢癌[9]等的發(fā)生密切相關(guān)。在腫瘤組織中，Raf可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，刺激腫瘤血管的生成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等[10]，也可通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，加快細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分解，進(jìn)而加強(qiáng)腫瘤的侵襲[11]，促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，Raf蛋白陽性表達(dá)率隨腫瘤的發(fā)展而升高，這與戴夢璐等[12]的研究結(jié)果一致。

Spry是一種能夠抑制受體酪氨酸激酶的蛋白質(zhì)，其在多種腫瘤組織中的表達(dá)被抑制。Spry蛋白可通過調(diào)節(jié)RTK-RAS-MAPK信號(hào)通路及其他通路來調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Spry在前列腺癌組織中表達(dá)被抑制，從而使RTK-RAS-MAPK通路被過度激活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14]。Spry可以通過負(fù)向調(diào)控生長因子信號(hào)通路抑制間充質(zhì)細(xì)胞的生長與分化[15]。此外，Spry蛋白可以通過負(fù)向調(diào)控RTK-RAS-MAPK信號(hào)通路進(jìn)而維持組織胚胎干細(xì)胞自我更新能力[16]。MOGHADDAM等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Spry在多種腫瘤中的表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)，有可能成為癌癥的獨(dú)立預(yù)后因子。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌中Spry蛋白的表達(dá)與病理分級(jí)有關(guān)。根據(jù)這一特性，希望能為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后判斷提供幫助。

Raf與Spry在RTK-RAS-MAPK通路中相互制約，維持細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)，當(dāng)Raf發(fā)生突變或被激活后，Spry表達(dá)被抑制，引起該通路平衡失調(diào)，致使細(xì)胞核中的一些轉(zhuǎn)錄因子如c-Jun等被磷酸化，并與其他蛋白激酶共同啟動(dòng)下游一系列相關(guān)基因，促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，加速DNA合成，參與細(xì)胞分裂及多種生理功能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，Spry編碼的蛋白質(zhì)失調(diào)可促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌Hela細(xì)胞株細(xì)胞周期的改變，加快細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞凋亡，致使宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變程度的加重，Raf陽性表達(dá)率增高，Spry陽性表達(dá)率降低，二者在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Raf蛋白的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Spry蛋白的表達(dá)與病理分級(jí)有關(guān)，可能成為評(píng)估宮頸鱗狀細(xì)胞癌惡性程度，預(yù)測轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)之一。