趙 欣，裴科陽，譚 軍

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺血性腦卒中是指因腦部血液循環(huán)障礙，缺血、缺氧所致的局限性腦組織缺血性壞死或軟化，病情嚴重者會導致殘疾甚至死亡[1-2]。靜脈溶栓治療是急性缺血性腦卒中發(fā)生后最重要的恢復血流的措施[3]。血流再通可以縮小腦梗死范圍，改善患者預后，但也可造成缺血腦組織病變進一步加重，即再灌注損傷[4]。減少再灌注損傷成為提高靜脈溶栓治療效果的關鍵。腺苷是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護劑，大量基礎實驗證明，對于局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠，腺苷預處理可縮小腦梗死范圍，減輕神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[5-7]。氧化應激是腦缺血再灌注損傷的基本病理機制，腦缺血再灌注后線粒體生成過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導了氧化應激[4]，而ROS與線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ及總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)關系密切[4，8-11]。本研究旨在觀察腺苷預處理對大鼠腦缺血再灌注后線粒體ROS含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性和腦組織TAC的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物無特定病原體級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只，體質(zhì)量190～210 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.2主要藥品、試劑與儀器腺苷、線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ活性檢測試劑盒、線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ活性檢測試劑盒、TAC檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，組織線粒體分離試劑盒、雙辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)，ROS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。2432-A2型線栓(北京西濃科技有限公司)，MLS-3750高壓蒸汽滅菌器(日本三洋貿(mào)易株式會社)，Heraeus Fresco 21微量離心機、Multiskan FC 酶標儀、-80 ℃超低溫冷凍柜(美國賽默飛世爾科技公司)，DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州翔天實驗儀器廠)，Agilent Cary Eclipse 熒光分光光度計(美國安捷倫科技有限公司)，UV-2600紫外可見分光光度計(日本島津制作所)。

1.3實驗方法

1.3.1腺苷注射液的配制避光條件下稱取 36 mg 腺苷粉末，溶于12 mL生理鹽水中，避光放入4 ℃冰箱內(nèi)保存[12]。

1.3.2動物分組及預處理采用隨機數(shù)字表法將18只SD大鼠分為假手術組、缺血再灌注組和腺苷預處理組，每組6只。大鼠適應性飼養(yǎng)3 d，在造模前3 d腺苷預處理組大鼠腹腔注射腺苷注射液(1.5 mg·kg-1)[13]，每日1次；假手術組和缺血再灌注組大鼠在相同時間點腹腔注射2 mL生理鹽水。

1.3.3模型制備大鼠術前禁食12 h，自由飲水，缺血再灌注組和腺苷預處理組大鼠采用改良線栓法制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[14]。血流阻斷2 h后將線栓拔出，形成再灌注。假手術組大鼠術中只分離血管，不插入線栓。依據(jù)Zea-Longa′s標準評分法[15]對大鼠神經(jīng)功能缺損進行評分，1～3分為造模成功。

1.3.4缺血區(qū)腦組織的分離及線粒體提取造模后24 h，參考ASHWAL等[16]的方法分離缺血區(qū)腦組織。大鼠麻醉，2 min內(nèi)完成斷頭取腦，將整個腦組織放入冰上預冷的生理鹽水中洗凈，去除血液，切除殘余嗅球、小腦和腦干，從額葉前端開始，在 3 mm 和9 mm處進行冠狀切片，留下中間6 mm厚的腦組織，從大腦縱裂左移2 mm進行矢狀切片，切下的左半部分腦組織即為缺血區(qū)腦組織。采用梯度離心法提取線粒體，將提取的線粒體加入適量線粒體儲存液重懸，立即使用或放入-80 ℃冰箱保存。

1.3.5線粒體中ROS水平測定參考杜肖等[17]的方法，利用熒光探針2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，使用化學熒光法測大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平。將線粒體懸液、磷酸鹽緩沖液與10 mmol·L-1的DCFH-DA混勻，使DCFH-DA工作濃度為10 μmol·L-1，37 ℃孵育30 min，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長525 nm條件下測熒光強度。采用BCA法檢測樣品蛋白含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。以熒光強度與蛋白含量的比值(F·mg-1)表示ROS水平。

1.3.6線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性測定采用分光光度法測定復合體Ⅰ、Ⅲ的活性。將-80 ℃冷存的線粒體懸液置于冰上溶解，用超聲波破碎線粒體，充分釋放線粒體內(nèi)的呼吸鏈復合體。將 40 μL 樣本與860 μL試劑混勻后即刻和2 min后分別測340 nm下吸光度(A)值，二者差值為△A1。另取 40 μL 樣本與900 μL試劑混勻后即刻和2 min后分別測550 nm下A值，二者差值為△A2。采用BCA法測樣本蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。復合體Ⅰ活性=1 808×△A1/C，復合體Ⅲ活性=615×△A2/C；C為樣本蛋白質(zhì)濃度(g·L-1)。

1.3.7TAC測定將缺血區(qū)部分腦組織再次進行冠狀切片，取1 mm厚的組織切片，按照組織質(zhì)量(g)提取液體積(mL)為15的比例進行冰浴勻漿，然后4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清液作為檢測樣品。使用分光光度法在593 nm下測樣品管和對照管的A值。采用BCA法檢測樣品蛋白濃度，具體操作參見試劑盒說明書。以蛋白濃度計算TAC，TAC=53.9×(△A-0.129 1)/C；△A=A樣品-A對照，C為樣品蛋白濃度(mg·mL-1)。

2 結果

2.13組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平比較假手術組、缺血再灌注組和腺苷預處理組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平分別為(1 676±684)、(4 584±1 430)、(2 252±624)F·mg-1。缺血再灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.122，P=0.000)；腺苷預處理組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平顯著低于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.107，P=0.001)。

2.23組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性比較結果見表1。缺血再灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性顯著低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.632、3.472，P=0.002、0.003)；腺苷預處理組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性顯著高于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.623、2.193，P=0.019、0.045)。

表13組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅲ活性比較

組別n復合體Ⅰ活性/(nmol·min-1·mg-1)復合體Ⅲ活性/(nmol·min-1·mg-1)假手術61.84±0.2110.98±2.37缺血再灌注組60.97±0.54a5.22±3.47a腺苷預處理組61.60±0.43b8.86±2.66b

注：復合體I活性為常用對數(shù)(lg)轉(zhuǎn)換后結果；與假手術組比較aP<0.05；與缺血再灌注組比較bP<0.05。

2.33組大鼠缺血區(qū)腦組織TAC比較假手術組、缺血再灌注組和腺苷預處理組大鼠缺血區(qū)腦組織TAC分別為(10.66±1.67)、(8.61±2.67)(10.18±1.36)U·mg-1，3組大鼠缺血區(qū)腦組織TAC比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.755，P=0.207)。

3 討論

正常生理條件下，腦組織線粒體產(chǎn)生少量的ROS，可被機體抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)清除。缺血再灌注過程中，腦組織線粒體生成ROS增多，超過機體的抗氧化能力，過多的ROS使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA發(fā)生過氧化，導致氧化損傷，最終造成細胞死亡[4，18-19]。組織細胞對抗氧化應激的方式有3種：調(diào)控ROS的生成、利用抗氧化系統(tǒng)清除ROS及修復ROS帶來的損傷[20]?？梢?，ROS水平受ROS生成來源與機體抗氧化系統(tǒng)的影響。

腦缺血再灌注可導致線粒體吸吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ活性降低，生成過多ROS[8]，其中復合體Ⅰ和Ⅲ是ROS的主要來源[9-11]。NOVGORODOV等[21]研究表明，腦缺血再灌注可使復合體Ⅲ活性降低，導致ROS大量生成并損傷大腦。機體抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)[4]，TAC由抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)共同組成，反映機體整體清除ROS的能力，可以對機體抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)協(xié)同產(chǎn)生的抗氧化能力做出綜合評價[22-23]。

本研究結果顯示，造模后24 h，缺血再灌注組大鼠缺血區(qū)腦組織線粒體中ROS水平顯著高于假手術組，復合體Ⅰ、Ⅲ活性顯著低于假手術組，缺血再灌注組與假手術組TAC比較差異無統(tǒng)計學意義；表明缺血再灌注后線粒體中ROS水平增高的主要原因是復合體Ⅰ、Ⅲ活性降低；而腺苷預處理組線粒體中ROS水平顯著低于缺血再灌注組，復合體Ⅰ、Ⅲ活性顯著高于缺血再灌注組，腺苷預處理組與缺血再灌注組TAC比較差異無統(tǒng)計學意義；表明腺苷預處理對復合體Ⅰ和Ⅲ的活性有明顯的保護作用，避免了ROS的過多生成，此為腺苷預處理組線粒體ROS水平明顯低于缺血再灌注組的主要原因。

綜上所述，腺苷預處理可通過保護復合體Ⅰ、Ⅲ的活性，減少MCAO大鼠缺血再灌注后線粒體ROS生成，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。