石華洪,苗 亮*,李明云,徐玉敏,張 浩,方 磐,陳曉升,陳政榜,黃翔暉

(1.寧波大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室,中國浙江寧波315211；2.寧德市眾合農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,中國福建寧德352100；3.福州海馬飼料有限公司,中國福建福州350311)

溶氧量(dissolved oxygen,DO)是水生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵理化因子之一,會直接影響魚類等水生生物的生長和生活。近年來,水體污染、富營養(yǎng)化等引起的水體低氧現(xiàn)象在全球范圍都有加劇的趨勢,對近海生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了很大的威脅[1～2]。嚴重水體低氧的水域會形成生物無法生存的“死區(qū)”,而亞致死濃度的低氧會對水生生物的行為、生理、代謝、遺傳和繁殖等造成不同程度的影響[3]。另外,為了提高水體利用率、增加產(chǎn)出,人們在水產(chǎn)育苗和養(yǎng)殖中常常會加大養(yǎng)殖密度,雖然會采取增氧措施,但仍時常出現(xiàn)因溶氧量不足導(dǎo)致的死亡和減產(chǎn)。研究顯示,魚類的運動、攝食、代謝狀態(tài)、激素水平等均與水體溶氧量密切相關(guān)[4～5],水體低氧除會造成魚的存活率下降、生長減緩?fù)鈁6～7],還會干擾魚體免疫、生殖等機能[8～9]。有意思的是,在對生存環(huán)境長期適應(yīng)的基礎(chǔ)上,有些魚類也會通過提高呼吸頻率、增大鰓絲面積、增強血氧親和力等對低氧環(huán)境產(chǎn)生一定的適應(yīng)和耐受[10]。因此,研究溶氧量對魚類的影響既有探究生物體應(yīng)對環(huán)境變化、適應(yīng)環(huán)境機制的理論意義,又對保護魚類資源、指導(dǎo)生產(chǎn)實踐有參考價值。

香魚(Plecoglossus altivelis)屬胡瓜魚目(Osmeriformes)、香魚科(Plecoglossidae)、香魚屬(Plecoglossus),俗稱油香魚、留香魚、仙胎魚等,是一種一年生的小型名貴經(jīng)濟魚類,肉質(zhì)細嫩多脂、散發(fā)特殊的清香味,有“淡水魚之王”的美譽。香魚成魚生活在通海溪流中,秋季產(chǎn)卵后死亡,孵化出的仔魚在近海越冬后洄游至溪流中。香魚對水質(zhì)要求高,對環(huán)境因子和污染物非常敏感,由于過度捕撈、棲息地被破壞和污染等,我國香魚野生資源已瀕臨衰竭。目前,我國已實現(xiàn)了香魚的全人工育苗和養(yǎng)殖[11],在浙江、福建形成了規(guī)?；挠绾宛B(yǎng)殖產(chǎn)業(yè),并且浙江的寧波、溫州以及遼寧的丹東等地進行了增殖放流以恢復(fù)野生資源。香魚的攝食和消化較為特殊,其生性貪吃,投餌越多吃得越多,且飽食后會邊攝食邊排遺,未被充分消化、吸收就被排出體外的飼料會污染水質(zhì),導(dǎo)致溶氧量降低,這樣既影響了香魚生長又浪費了飼料。Nagasaka等[12]推測香魚一年生的短生命周期可能與攝食、營養(yǎng)有關(guān)。目前,關(guān)于溶氧量對香魚影響的研究較少,僅李明云等[13]檢測了香魚苗種的窒息點和耗氧率,結(jié)果表明香魚幼魚(平均體長5 cm)在水溫11.5℃和27.5℃時的窒息點分別為溶氧量2.014 mg/L和2.272 mg/L,明顯高于草魚(Ctenopharyngodon idellus)、羅非魚(Oreochromis niloticus)等魚類的窒息點。在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、鯔(Mugil cephalus)等魚類中的研究均顯示低溶氧下魚生長減慢、代謝率降低[5,14],但尚未見關(guān)于低溶氧對香魚生長影響的報道。

基于上述分析可知,研究溶氧等環(huán)境因子對香魚生長的影響在保護和恢復(fù)香魚野生資源以及指導(dǎo)育苗和養(yǎng)殖生產(chǎn)中均具有重要意義。本研究檢測了不同低溶氧水平對香魚幼魚生長和消化酶活性的影響,旨在為從攝食和消化角度研究香魚對低氧環(huán)境的反應(yīng)和適應(yīng)機制奠定基礎(chǔ),并為今后深入研究香魚營養(yǎng)代謝和調(diào)控機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗在寧德市眾合農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司進行,動物材料為該公司繁育的“浙閩1號”香魚幼魚(80日齡)。經(jīng)暫養(yǎng)后將魚隨機分配到容積為30 L的水桶中,每桶50尾,每個桶的空氣曝氣量和氮氣曝氣量均通過氣體流量計(常州市科德熱工儀表有限公司)單獨控制以實現(xiàn)不同的水體溶氧水平,使用SX725型溶氧儀(上海三信儀表廠)每8 h檢測水體溶氧量1次。根據(jù)國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(GB 11607-1989)對漁業(yè)水域溶氧量的要求:“連續(xù)24 h養(yǎng)殖中,16 h以上的溶氧量必須大于5 mg/L,其余任何時候不得低于3 mg/L”,結(jié)合在養(yǎng)殖中水體溶氧保持在約7.5 mg/L的水平以及香魚幼魚窒息點在2.272 mg/L的實際情況,并參考黃顙魚、鯔研究中溶氧水平的設(shè)置[5,14],本研究共設(shè)置3個不同的溶氧水平:1)DO=7.5 mg/L的正常溶氧對照組；2)DO=4.5 mg/L的輕度低氧脅迫實驗組；3)DO=3.0 mg/L的重度低氧脅迫實驗組。每組均設(shè)置3個重復(fù),各組的空氣曝氣量、氮氣曝氣量及實測水體溶氧量見表1。實驗用水為鹽度8～9的過濾海水,實驗期間水溫15±1℃、光周期12L(light)∶12D(dark)。

投喂福州海馬飼料有限公司生產(chǎn)的海馬牌香魚顆粒飼料,每日8:00、12:00和16:00分別投喂1次,投喂量為香魚幼苗體重的5%。每次投喂1 h后清理桶底殘餌與糞便。各實驗桶每天換水1次,換水量為50%。

1.2 生長測量與消化酶活性測定

實驗共進行21 d,各組實驗魚在此期間均無死亡,存活率為100%。在實驗前(0 d)和實驗開始后的7 d、14 d和21 d分別進行測量和采樣。每次從各桶中隨機取10尾魚,用丁香酚麻醉后稱重,然后立即冰上解剖,取胃和腸放入1.5 mL的離心管中,液氮速凍后-80℃保存。

根據(jù)測得的體重計算各組魚在0～7 d、7～14 d和14～21 d期間的增重率(weight gain rate,WGR),公式為:WGR=(Wt-Wo)/Wo×100%,其中 Wt和Wo分別為各階段的平均終重(g)、平均初重(g)。

將采集的香魚消化道樣品稱重后按質(zhì)量體積比1∶9加入勻漿介質(zhì)(0.65%NaCl溶液),冰水浴下勻漿,用NanoDrop微量分光光度計(ThermoFisher公司)測定組織勻漿的蛋白質(zhì)濃度。用購自南京建成生物工程研究所的α-淀粉酶測試盒(碘-淀粉比色法)、胃蛋白酶測定試劑盒(比色法)、胰蛋白酶測定試劑盒(紫外比色法)和脂肪酶測試盒分別測定各種消化酶的活性。

淀粉酶活性測定:準備測定管和空白管各1支,向空白管中加入0.5 mL預(yù)熱至37℃的底物緩沖液,向測定管中加入0.5 mL預(yù)熱至37℃的底物緩沖液和0.1 mL組織勻漿樣品,混勻后將兩支管放入37℃水浴7.5 min,然后向空白管中加入0.5 mL碘反應(yīng)液和3.1 mL雙蒸水,向測定管中加入0.5 mL碘反應(yīng)液和3.0 mL雙蒸水,混勻后用紫外分光光度計檢測660 nm下的吸光度,記錄OD值?？瞻坠躉D值記作A1,測定管OD值記作A2。按試劑盒說明書中的公式計算淀粉酶活力:淀粉酶活性[樣品量×樣品蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)］其中樣品量為0.1 mL。

胃蛋白酶活性的測定分兩步進行:1)酶促反應(yīng)。準備測定管和對照管各1支,分別加入0.04 mL組織勻漿樣品,37℃水浴預(yù)溫2 min,隨后向測定管中加入0.2 mL試劑二,向?qū)φ展苤屑尤?.4 mL試劑一和0.2 mL試劑二,充分混勻后37℃水浴10 min,然后向測定管中加入0.4 mL試劑一,充分混勻后將兩支試管再次37℃水浴10 min,3 500 r/min離心10 min后分別取上清0.3 mL用于第二步的顯色反應(yīng)；2)顯色反應(yīng)。準備空白管、標(biāo)準管、測定管、對照管共4支試管,分別加入1.5 mL試劑三和0.3 mL試劑四,然后向空白管中加入0.3 mL標(biāo)準品稀釋液,向標(biāo)準管中加入50 μg/mL應(yīng)用液0.3 mL,向測定管中加入0.3 mL第一步中的測定管上清,向?qū)φ展苤屑尤?.3 mL第一步中的對照管上清,各管中的溶液充分混勻后37℃水浴20 min,用經(jīng)蒸餾水調(diào)零的紫外分光光度計于660 nm處測定吸光度OD值?？瞻坠?、標(biāo)準管、測定管、對照管的 OD 值分別記作 A1、A2、A3、A4。按試劑盒說明書中的公式計算胃蛋白酶活性:

表1 各組的空氣、氮氣曝氣量和實測水體溶氧量Table 1 Measured DO values,air flow and nitrogen flow in each group

其中,標(biāo)準品濃度為50 μg/mL；反應(yīng)時間為10 min；反應(yīng)液總體積為0.64 mL；樣品量為0.04 mL。

胰蛋白酶活性測定:準備測定管和空白管各1支,分別加入1.5 mL胰蛋白酶底物反應(yīng)液,放入37℃水浴中預(yù)溫5 min,然后向空白管中加入0.015 mL標(biāo)準品,向測定管中加入0.015 mL組織勻漿樣品,并開始計時,混勻后分別倒入石英比色皿中,用紫外分光光度計于253 nm處記錄30 s時的吸光度OD值(記作A1)；將比色皿中的反應(yīng)液倒入原試管中,放入37℃水浴20 min,于20 min 30 s時再次記錄253 nm處的吸光度OD值(記作A2)；分別計算測定管和空白管的△A=A1-A2。按試劑盒說明書中的公式計算胰蛋白酶活性:胰蛋白酶活性(U/mg)=[樣品量×樣品蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)]

其中,反應(yīng)時間為20 min；反應(yīng)液總體積為1.515 mL；樣品量為0.015 mL。

脂肪酶活性測定:首先檢測測定管的吸光度。向試管中加入25 μL組織勻漿上清液,再加入25 μL試劑四,吸取2 mL預(yù)熱至37℃的底物緩沖液沖入試管中,快速混勻并計時,迅速將液體倒入比色皿中,放入事先用Tris緩沖液調(diào)零的紫外分光光度計中于420 nm比濁,30 s時讀取吸光度值(記作A1)；將此比色液倒入原試管中并于37℃水浴10 min,再迅速倒入比色皿中,10 min 30 s時讀取吸光度值(記作A2)。其次測定標(biāo)準管的吸光度。取底物緩沖液2 mL,同時加入生理鹽水50 μL,于420 nm處比濁,讀取吸光度OD值(記作As)。按試劑盒說明書中的公式計算脂肪酶活性:脂肪酶活性

其中,標(biāo)準管濃度為454 μmol/L,反應(yīng)液總體積為2.05 mL,樣品量為0.05 mL,反應(yīng)時間為10 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2017軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準差(±s)表示。用SPSS 21.0軟件對不同組的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 溶氧量對香魚幼魚生長的影響

由圖1可知,在3組香魚幼魚的初始體重(Wo)基本一致(DO=7.5 mg/L 組 0.55±0.33 g、DO=4.5 mg/L 組 0.56±0.35 g、DO=3.0 mg/L 組 0.56±0.36 g)的情況下,經(jīng)低氧脅迫后兩組實驗魚的體重均顯著低于對照組(P＜0.05):DO=4.5 mg/L的實驗組魚在7 d、14 d、21 d時的體重分別比對照組魚輕18.27%、10.89%和10.89%,DO=3.0 mg/L的實驗組在這3個時間點的體重分別比對照組輕20.33%、17.03%和20.73%。

進一步對3組魚在各階段的體重增重率展開分析,結(jié)果如表2所示。0～7 d是造成兩個實驗組魚生長速率減慢的關(guān)鍵階段,7 d時對照組魚的體重增長了21.31%,而DO=4.5 mg/L和DO=3.0 mg/L兩個實驗組的魚則均出現(xiàn)體重負增長,增重率分別為-2.30%和-4.78%；之后兩個實驗組魚均恢復(fù)生長,其中DO=4.5 mg/L組在7～14 d和14～21 d期間以及DO=3.0 mg/L組在7～14 d期間的增重率均高于對照組。

表2 低氧脅迫下香魚幼魚增重率變化(n=10)Table 2 Changes of WGR of juvenile sweet fish under hypoxic stress(n=10)

2.2 溶氧量對香魚幼魚淀粉酶活性的影響

表3的結(jié)果顯示,在實驗期間對照組香魚的淀粉酶活性逐漸升高,而兩個低氧脅迫實驗組的淀粉酶活性與對照組相比都有不同程度的降低。從時間上來看,溶氧量越低對淀粉酶活性產(chǎn)生的影響越早出現(xiàn):DO=3.0 mg/L組7 d時的淀粉酶活性已顯著低于對照組(P＜0.05),僅為對照組活性的79.96%；而DO=4.5 mg/L組的淀粉酶活性在7 d時與對照組相當(dāng),在14 d時顯著低于對照組(P＜0.05),為對照組活性的75.27%。從影響程度上來看,水體溶氧水平越低淀粉酶活性降低幅度越大:14 d時DO=4.5 mg/L組和DO=3.0 mg/L組的淀粉酶活性分別比對照組降低了24.73%和28.01%。另外,香魚幼魚的淀粉酶活性對低氧脅迫有一定的適應(yīng)性,21 d時兩個實驗組的淀粉酶活性均有所恢復(fù),雖都低于對照組但差異均不顯著(P＞0.05)。

圖1 低氧脅迫對香魚幼魚體重的影響(n=10)*表示與對照組相比具有顯著性差異；◆表示與實驗組1相比具有顯著性差異。Fig.1 Effects of hypoxic stress on the body weight of juvenile sweet fish(n=10)*represents the significant difference compared with the control group；◆ represents the significant difference compared with the test group 1.

2.3 溶氧量對香魚幼魚蛋白酶活性的影響

兩個低氧脅迫組香魚的胰蛋白酶活性在整個實驗期間均與對照組水平相當(dāng),未出現(xiàn)顯著變化(P＞0.05)(表4),表明香魚體內(nèi)的胰蛋白酶活性對低氧不敏感。與胰蛋白酶不同,胃蛋白酶活性受低氧影響較大,低氧脅迫7 d時兩個實驗組的胃蛋白酶活性均顯著低于對照組(P＜0.05),并且溶氧量越低胃蛋白酶活性下降幅度越大；14 d時兩個低氧脅迫實驗組的胃蛋白酶活性均有所恢復(fù),雖略低于對照組但差異不顯著(P＞0.05)；21 d時兩個低氧脅迫組的胃蛋白酶活性均再次顯著低于對照組(P＜0.05),其活性分別僅為對照組的58.40%、62.34%(表5)。

2.4 溶氧量對香魚幼魚脂肪酶活性的影響

表6結(jié)果顯示,香魚幼魚的脂肪酶活性在低氧脅迫下顯著降低。7～21 d期間兩個低氧脅迫組的脂肪酶活性均顯著低于對照組(P＜0.05),并且溶氧量越低脂肪酶活性降低幅度越大,21 d時DO=4.5 mg/L組和DO=3.0 mg/L組的脂肪酶活性分別只有對照組的84.41%和76.02%。

3 討論

表3 不同低氧水平對香魚幼魚淀粉酶活性的影響(n=10)Table 3 Effects of different DO concentrations on the activity of amylase in juvenile sweet fish(n=10)

溶氧量是水體中最重要的水化學(xué)因子,對各種水生生物的生長、活動和繁殖有重要影響。自然水體的溶氧水平可影響生物的分布和種群組成,養(yǎng)殖水體的溶氧量關(guān)系著水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量和收益。研究發(fā)現(xiàn),水中溶氧≤4 mg/L時,會對魚類產(chǎn)生負面影響,使其出現(xiàn)生長緩慢、發(fā)育延遲、代謝受阻等現(xiàn)象。比如:黃顙魚幼魚在低氧環(huán)境中常處于靜止?fàn)顟B(tài),且攝食時間短、游泳緩慢[5]；鯔幼魚的特定生長率隨著溶氧水平的降低而減小[14]；低氧組斑點狼魚(Anarhichas minor)的平均體重及食物消費均低于高氧組和對照組[15]；低氧脅迫下銀鯰(Rhamdia quelen)體重和體長的增長都明顯降低[16]。香魚對水體低氧較為敏感,個體小的香魚苗種耐低氧能力更差,其窒息點也高于草魚、尼羅羅非魚等魚類[13]。在本實驗中,低氧脅迫下兩個實驗組的香魚幼魚均出現(xiàn)游動減少、攝食不夠積極等現(xiàn)象,其中DO=3.0 mg/L組尤為明顯；經(jīng)21 d的低氧脅迫后兩個實驗組魚的體重均顯著小于對照組,且溶氧水平越低生長受抑制程度越大,這與其他魚類的研究結(jié)果一致,表明水體低氧會抑制魚體的生長代謝。需要指出的是,魚體對水體低氧也有一定的適應(yīng)能力,如在低氧脅迫處理一段時間后,輕微缺氧環(huán)境下的鯔獲得了完全補償生長,但較嚴重缺氧環(huán)境下的鯔其體重最終未能趕上對照組,失去了補償生長的能力[14]。本研究中對香魚幼魚階段性增重率的分析顯示,低氧脅迫的第1周兩個實驗組體重均為負增長,之后兩周均為正增長,且低氧脅迫第2周時兩個實驗組均出現(xiàn)補償性生長,增重率高于對照組,但第3周時3.0 mg/L的低氧脅迫組增重率低于對照組和4.5 mg/L低氧脅迫組,表明較嚴重低氧對生長的抑制超過了魚體的補償生長能力,因此在香魚育苗和養(yǎng)殖中要避免長時間嚴重低氧,以防低氧對幼魚的生長發(fā)育造成不良影響。

表4 不同低氧水平對香魚幼魚胰蛋白酶活性的影響(n=10)Table 4 Effects of different DO concentrations on the activity of trypsin in juvenile sweet fish(n=10)

表5 不同低氧水平對香魚幼魚胃蛋白酶活性的影響(n=10)Table 5 Effects of different DO concentrations on the activity of pepsin in juvenile sweet fish(n=10)

表6 不同低氧水平對香魚幼魚脂肪酶活性的影響(n=10)Table 6 Effects of different DO concentrations on the activity of lipase in juvenile sweet fish(n=10)

消化酶的發(fā)生是隨著動物的生長發(fā)育而演變的,而不是由攝食、飼料成分改變引起的,但消化酶活性的演變可以反映出魚類消化系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)需求的變化[17]。消化道器官內(nèi)存在各種消化酶,主要功能是將攝入的大分子營養(yǎng)物質(zhì)水解為可吸收的小分子營養(yǎng)素,以便機體能夠充分吸收利用[18]。趙慧慧等[19]的研究表明,較高溶氧水平對虹鱒的消化合成能力具有促進作用,各消化器官內(nèi)酶活性升高。人們在棕蝦(Farfantepenaeus californiensis)的研究中也發(fā)現(xiàn)低氧會造成消化酶活性降低[20]。本實驗的結(jié)果表明,在3.0 mg/L的低氧脅迫下香魚胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均顯著低于正常溶氧水平的對照組,提示低氧脅迫下香魚生長的減慢可能與消化酶活性降低而影響食物的消化吸收有關(guān)。雖然低氧脅迫下香魚淀粉酶、胃蛋白酶、脂肪酶活性都出現(xiàn)降低,但隨著脅迫時間的延長,淀粉酶活性在21 d時恢復(fù)到了與對照組相當(dāng)?shù)乃?脂肪酶活性也能維持在較穩(wěn)定的水平,這幾種消化酶活性的恢復(fù)可能是魚體在經(jīng)歷初期低氧脅迫造成的生長抑制后又出現(xiàn)補償性生長的原因之一。而胃蛋白酶活性則未表現(xiàn)出對低氧環(huán)境的適應(yīng),21 d時兩個低氧脅迫組的胃蛋白酶活性僅為對照組的60%左右。以上信息表明,香魚幼魚體內(nèi)的各種消化酶活性對低氧的敏感性存在差異。

本研究結(jié)果表明低氧脅迫會導(dǎo)致香魚幼魚的生長減慢,這與低氧環(huán)境下各種消化酶活性降低有關(guān),其中胃蛋白酶活性受低氧影響最大。因此,在香魚工廠化高密度育苗、養(yǎng)殖中都要注意保持足夠的水體溶氧量。