任曉倩，張海軍，耿檸波，王菲迪，張保琴，羅云，陳吉平,*

1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021

氯化石蠟(chlorinated paraffins, CPs)是一類人工合成的氯代正構(gòu)烷烴，根據(jù)其碳鏈長(zhǎng)度的不同，可分為短鏈(SCCPs, C10-13)、中鏈(MCCPs, C14-17)和長(zhǎng)鏈(LCCPs, C18-30)氯化石蠟[1]。由于具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，氯化石蠟被廣泛用作塑料和橡膠的阻燃劑和增塑劑、皮革柔順劑、紡織物整理劑和金屬加工過程的切削液等，在生產(chǎn)和使用過程中不斷向環(huán)境釋放[2]。

在氯化石蠟產(chǎn)品中，SCCPs已被證實(shí)具有遠(yuǎn)距離環(huán)境遷移能力、環(huán)境持久性、生物累積性和較高毒性[3]。2017年5月，SCCPs被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》附錄A的受控清單[4]，單獨(dú)的SCCPs產(chǎn)品生產(chǎn)被要求停止。聯(lián)合國(guó)環(huán)境署的SCCPs風(fēng)險(xiǎn)管理評(píng)估報(bào)告中，推薦考慮MCCPs和LCCPs作為SCCPs的代替物，其可行性仍有待進(jìn)一步評(píng)估[5]。中國(guó)是世界上最大的CPs生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)，生產(chǎn)企業(yè)高達(dá)150余家，產(chǎn)能超過100萬t[6-7]。氯化石蠟普遍存在于環(huán)境介質(zhì)和生物體中，并在人體內(nèi)富集[8]。初步調(diào)查結(jié)果表明，SCCPs在中國(guó)人體血液和母乳中的含量分別為14～3 500 μg·L-1和5.24～644 μg·L-1；MCCPs在中國(guó)人體血液和母乳中的含量分別為6.3～320 μg·L-1和0.89～60 μg·L-1；LCCPs在中國(guó)人體血液中的含量為1.0～21 μg·L-1[9-10]。

已有的毒理學(xué)研究表明，SCCPs對(duì)嚙齒類動(dòng)物具有肝毒性[11]、腎毒性[12]和甲狀腺毒性[13]，長(zhǎng)期暴露具有致癌性[14]，并且具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[11,15-17]。然而，關(guān)于MCCPs和LCCPs的毒性研究相對(duì)較少。由于MCCPs具有與SCCPs相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，根據(jù)“化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制”法規(guī)原則，二者均被歐盟列入內(nèi)分泌干擾物候選清單[6]。研究單次飼喂MCCPs對(duì)Wistar大鼠的毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，MCCPs(C14-17, 51%～60% Cl)會(huì)導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生豎毛、昏睡和尿失禁的行為現(xiàn)象[18]。研究發(fā)現(xiàn)，MCCPs(C14-17, 40% Cl)會(huì)引起大鼠和小鼠的肝細(xì)胞腫大、過氧化物酶體增殖以及肝細(xì)胞平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增殖[18]。此外，Bucher等[14]發(fā)現(xiàn)，LCCPs能夠使小鼠產(chǎn)生肉芽腫性炎癥效應(yīng)。短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟可能具有顯著的毒性效應(yīng)差別，目前尚缺乏相應(yīng)的比較研究。

代謝組位于基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組下游，污染物在不同層面的毒性效應(yīng)可以靈敏地反映在代謝組的變化上；同時(shí)，代謝組的變化能為毒性作用機(jī)制和生物表型狀態(tài)之間的關(guān)系提供一個(gè)深入觀察的視角[19]。本研究以人肝癌細(xì)胞HepG2為受試細(xì)胞，借助代謝組學(xué)研究方法，探討了在同一劑量水平下短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露對(duì)細(xì)胞小分子代謝物的干擾，從代謝組層面揭示三者毒性效應(yīng)的異同。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

3種氯含量相近的氯化石蠟標(biāo)準(zhǔn)品，包括SCCPs(51.5% Cl)、MCCPs(52% Cl)和LCCPs(49% Cl)標(biāo)準(zhǔn)品購于德國(guó)Labor Dr. Ehrenstorfer-Sch?fers公司，質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1，溶于環(huán)己烷。細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)購自美國(guó)Gibco公司，青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于Hyclone公司(Logan, UT)。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、ACS級(jí)二甲基亞砜(DMSO)購自美國(guó)AMRESCO公司(Amresco, Solon, OH, USA)，純度>98%；質(zhì)譜純乙腈和甲醇購自德國(guó)Merck公司，色譜級(jí)甲酸購自日本TCI公司，色譜級(jí)碳酸氫銨購自中國(guó)百靈威公司。1-十二烷基溶血卵磷酯(LPC 12:0)和1-月桂酰-2-羥基-sn-甘油酸-3-卵磷脂1,2-二十七烷酰-sn-甘油酸-3-磷酸乙醇胺(PE 17:0)購自美國(guó)AVANTI公司，D5-L-苯丙氨酸和(D3-8,8,8)-L-辛?；鈮A購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，十一烷酸(FFA C11:0)和十九烷酸(FFA C19:0)購自阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(Millipore, Billerica, MA, USA)。

1.2 儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV/BB5060UV，Heraeus，德國(guó))；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Biofuge?Stratos，Heraeus，德國(guó))；超聲細(xì)胞破碎儀(SCIENTZ JY 96-IIN，寧波新芝)；超低溫冰箱(NUAIRE NU-6382E，美國(guó))；倒置顯微鏡(XD-101型，南京江南光電股份有限公司)；微板振蕩器(LAB-LINE 4625-1，美國(guó))，冷凍干燥機(jī)(Genesis 25&35，美國(guó))；渦旋振蕩儀(Scientific Industries G-560E，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F50，瑞士)；液相色譜(Waters Acquity UPLC，美國(guó))/串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(AB SCIEX Q-Trap 5500，美國(guó))；液相色譜(Agilent 1290 UPLC，美國(guó))/串聯(lián)高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent 6540，美國(guó))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與暴露

人肝癌細(xì)胞HepG2在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種在96孔板，用于細(xì)胞增殖活性測(cè)試，接種密度為4×104細(xì)胞/孔，待細(xì)胞鋪滿96孔板的80%后進(jìn)行CPs暴露試驗(yàn)。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，用于代謝干擾試驗(yàn)研究，接種密度為3×105細(xì)胞/孔，待細(xì)胞鋪滿6孔板的80%后進(jìn)行暴露試驗(yàn)，暴露時(shí)間為24 h。3個(gè)氯化石蠟暴露組的暴露劑量均為100 μg·L-1，這一濃度與氯化石蠟在人體血液中的含量水平相當(dāng)[9]。氯化石蠟分別溶解在DMSO中引入細(xì)胞培養(yǎng)液，DMSO在培養(yǎng)液中的終濃度為0.05%(V/V)，空白對(duì)照組僅包含0.05%的DMSO。對(duì)照組和3個(gè)暴露組均設(shè)置6個(gè)平行。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

細(xì)胞活力采用MTT法檢測(cè)。暴露試驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT液(5 mg·mL-1，溶于PBS緩沖溶液)，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，溶解活細(xì)胞與MTT結(jié)合形成的紫色晶體。室溫下，將96孔板置于微孔板振蕩器上震蕩10 min，使結(jié)晶物溶解，采用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值。

1.3.3 小分子代謝物提取

采用細(xì)胞培養(yǎng)液分析代謝組的變化。細(xì)胞培養(yǎng)液中小分子代謝物與細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物具有平衡關(guān)系，因此，分析細(xì)胞培養(yǎng)液中代謝物的變化可反映細(xì)胞內(nèi)的代謝變化。并且，細(xì)胞培養(yǎng)液中小分子代謝物的分析具有基質(zhì)干擾小和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞暴露24 h后，移取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，冷凍干燥。加入500 μL包含6個(gè)內(nèi)標(biāo)的提取液(80%甲醇/水，V/V)，渦旋提取30 min，在13 000×g、8 ℃下，高速離心20 min，然后取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，并轉(zhuǎn)移到vail管中保存，待儀器分析。

1.3.4 小分子代謝物儀器分析

采用擬靶向代謝組學(xué)方法對(duì)胞外小分子代謝物進(jìn)行分析，該方法具有較好的重現(xiàn)性與較寬的線性范圍[20]。首先采用高分辨UPLC-Q-TOF MS的Auto MS/MS對(duì)分子量在50～1 000的代謝物進(jìn)行全掃描和二級(jí)質(zhì)譜掃描，以獲得離子對(duì)信息。然后，采用高靈敏度的UPLC-Q-Trap MS對(duì)獲得的離子對(duì)進(jìn)行Schedule MRM分析，離子化方式為電噴霧電離(ESI)，掃描模式為正負(fù)離子分別掃描。

正離子模式采用的色譜柱為Acquity UPLC BEH C8柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國(guó))，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速350 μL·min-1；流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液(V/V)，B為0.1%的甲酸乙腈(V/V)。流動(dòng)相梯度為：初始流動(dòng)相為10% B；3 min時(shí)上升到40% B；15 min時(shí)再上升到100% B，并保持5 min；20.1 min時(shí)回到10% B，平衡2.9 min。負(fù)離子模式采用的色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters，美國(guó))，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速350 μL·min-1；流動(dòng)相A為5 mmol·L-1碳酸氫銨的水溶液，B為5 mmol·L-1碳酸氫銨的甲醇溶液。流動(dòng)相梯度為：初始流動(dòng)相為2% B，保持1 min；3 min時(shí)上升到42% B；12 min時(shí)再上升到100% B，并保持4 min；16.1 min時(shí)回到2% B，平衡3.9 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

Q-TOF采集的數(shù)據(jù)用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00軟件進(jìn)行處理。Q-Trap得到的數(shù)據(jù)用AB SCIEX的MultiQuant 3.0.1軟件進(jìn)行峰識(shí)別和匹配，去掉缺失值后，導(dǎo)出ESI+和ESI-模式下經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正過的峰面積數(shù)據(jù)，合并為一個(gè)數(shù)據(jù)表進(jìn)行歸一化處理，以校正培養(yǎng)液質(zhì)量造成的差異。利用SIMCA-P 11.0軟件(Umetrics, Sweden)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，用以觀察實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和樣品分型；使用SPSS PASW軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和t-test，用以判斷代謝物在對(duì)照組和暴露組之間是否存在顯著性差異。聯(lián)合變量重要性因子值(variable importance in the projection, VIP)>1，且P<0.05被認(rèn)為是顯著差異代謝物。基于KEGG數(shù)據(jù)庫，采用IncroMap軟件(version 1.7.0)對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。

1.5 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證(QA/QC)

為確保代謝分析方法的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，所有樣本的混合樣用作質(zhì)量控制(QC)樣品插入分析序列。首先分析2次QC樣品，接著每隔6個(gè)待測(cè)樣品后插入一個(gè)QC樣品，共分析7次QC樣品。正離子模式下共檢測(cè)到313個(gè)色譜峰，其中61.0%色譜峰豐度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<10%，93.6%色譜峰豐度的RSD<20%。負(fù)離子模式下共檢測(cè)到157個(gè)色譜峰，67.5%色譜峰豐度的RSD<10%，92.4%色譜峰豐度的RSD<20%。此外，PCA結(jié)果表明，所有QC樣品的因子得分在第一主成分方向均落在2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的置信區(qū)間內(nèi)。這些結(jié)果表明，代謝物擬靶向分析序列具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，所得數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，滿足定量分析的要求。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 CPs暴露對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟均顯著降低了HepG2細(xì)胞的增殖活性，細(xì)胞平均活力分別降低了11.7%、8.8%和10.6%；但3個(gè)氯化石蠟暴露組的細(xì)胞活力沒有顯著差異。這一結(jié)果表明，氯含量相當(dāng)?shù)腟CCPs、MCCPs和LCCPs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性相近。

2.2 多變量模式識(shí)別分析與差異代謝物鑒定

擬靶向分析共檢測(cè)到470種代謝物，采用PLS-DA對(duì)短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露組和對(duì)照組的代謝物豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，表示模型解釋能力的參數(shù)R2=0.89，表示模型預(yù)測(cè)能力的參數(shù)Q2=0.74，證明PLS-DA結(jié)果可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象。由PLS-DA得分圖(圖2(a))可見，在第一主成分方向上，3個(gè)氯化石蠟暴露組均能與對(duì)照組明顯分開，表明氯化石蠟引起了細(xì)胞代謝活動(dòng)的紊亂。其中，SCCPs與LCCPs在2個(gè)主成分方向都能明顯分開，表明二者對(duì)細(xì)胞代謝的影響存在顯著差別；而MCCPs與SCCPs和LCCPs在2個(gè)主成分方向均不能明顯分開，表明MCCPs對(duì)細(xì)胞代謝的干擾效應(yīng)與二者皆有相似之處。通過計(jì)算代謝擾亂水平指數(shù)(MELI)，比較了不同碳鏈長(zhǎng)度氯化石蠟暴露對(duì)細(xì)胞總體代謝的干擾強(qiáng)度。如圖2(b)所示，3個(gè)氯化石蠟暴露組的MELI值與對(duì)照組相比都明顯升高，但3個(gè)暴露組的MELI值沒有顯著差異。SCCPs的平均MELI值略高于MCCPs和LCCPs的平均MELI值，表明SCCPs對(duì)細(xì)胞總代謝的干擾程度略高。

圖1 短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響注：Control表示對(duì)照組；SCCPs、MCCPs和LCCPs表示短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟，暴露濃度為100 μg·L-1，暴露時(shí)長(zhǎng)為24 h；**表示與對(duì)照組相比顯著性差別在0.01水平。Fig. 1 Effects of exposure to short-chain chlorinated paraffins (SCCPs), medium-chain chlorinated paraffins (MCCPs) and long-chain chlorinated paraffins (LCCPs) on the viability of HepG2 cellsNote: Exposure concentrations is 100 μg·L-1; exposure duration is 24 h; ** indicate the significant differences at 0.01 level in comparison to the control.

首先，利用Q-TOF高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)精確分子量及同位素分布在Agilent代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Metlin)中對(duì)檢測(cè)到的470種代謝物進(jìn)行初步定性，結(jié)合化合物二級(jí)質(zhì)譜圖信息在數(shù)據(jù)庫中對(duì)比確定代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過搜索網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫Human Metabolome Database、KEGG和Metlin對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[21]。經(jīng)過上述步驟后，共定性鑒定出195種代謝物。通過ANOVA分析，共找出94種差異且定性的代謝物(P<0.05，F(xiàn)DR<0.05且VIP>1)。

差異代謝物包括：12種氨基酸(AAs)、10種脂肪酸(FFAs)、8種肉堿、14種磷脂酰膽堿(PCs)、10種溶血磷脂酰膽堿(LysoPCs)、1種磷脂酰乙醇胺(PE)、2種溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPEs)、8種鞘磷脂(SMs)、1種溶血鞘磷脂(LysoSM)、6種三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物、3種嘌呤、2種嘧啶和17種其他代謝物。與對(duì)照組相比，PCs、LysoPCs、SMs、鳥氨酸、蘇氨酸和谷氨酸在3個(gè)暴露組中均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。FFAs、LysoPEs、肉堿、三羧酸循環(huán)相關(guān)代謝物和大部分AAs在3個(gè)暴露組中均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2.3 代謝通路富集分析

采用IncroMap軟件對(duì)94種差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫找出受顯著影響的代謝通路，從中選出P<0.05并且與肝代謝有關(guān)的通路。通路富集分析得到的Q值可反映代謝通路的受影響程度，根據(jù)Q值對(duì)這些通路進(jìn)行了分類，結(jié)果如圖3所示。3個(gè)暴露組中，共有14條代謝通路受到顯著影響，3組之間既有相似性又有差異性。短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟對(duì)5條脂類代謝通路擾亂最為劇烈，且三者影響程度相近，包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝和鞘磷脂代謝。3個(gè)暴露組均影響了3條氨基酸代謝通路，分別是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，?；撬岷蛠喤；撬岽x；除此之外，LCCPs還擾亂了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路。相比于SCCPs和MCCPs，LCCPs對(duì)氨基酸代謝表現(xiàn)出了更強(qiáng)的干擾效應(yīng)。

圖3 基于代謝通路富集分析獲得的短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露顯著干擾的代謝通路Fig. 3 The most relevant metabolic pathways perturbed by SCCPs, MCCPs and LCCPs exposure based on pathway enrichment analysis

2.4 對(duì)磷脂代謝的影響

磷脂不僅是細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核等)膜的重要組成成分，還參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的許多重要功能，如神經(jīng)傳導(dǎo)、降血脂和降低膽固醇等[22]。由代謝通路富集分析結(jié)果可知，氯化石蠟暴露對(duì)磷脂代謝的影響最為顯著。如圖4所示，在甘油磷脂代謝通路中，3種氯化石蠟均引起了細(xì)胞內(nèi)膜主要組成成分PCs及其水解產(chǎn)物L(fēng)ysoPCs的同步下調(diào)，LysoPCs的代謝物甘油磷脂膽堿(GP-C)和膽堿的含量也表現(xiàn)出顯著下調(diào)趨勢(shì)，表明PCs和LPCs的代謝降解被加強(qiáng)。此外，細(xì)胞外膜的主要組成成分SMs及其水解產(chǎn)物L(fēng)ysoSM的水平在3個(gè)氯化石蠟暴露組中均呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，表明SMs和LysoSMs的代謝降解也被加強(qiáng)。與對(duì)照組相比，PEs水平在SCCPs暴露組中顯著降低，而在MCCPs和LCCPs暴露組中則沒有明顯變化；LysoPEs在SCCPs暴露組中無明顯變化，在MCCPs和LCCPs暴露組中則顯著升高。此結(jié)果表明，3種氯化石蠟暴露均引起了PEs水解生成LysoPEs的反應(yīng)增強(qiáng)，并且MCCPs和LCCPs暴露可能抑制了PEs向PCs的轉(zhuǎn)化。溶血磷脂含量的升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，從而影響膜脂蛋白的有序性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。在本研究中，氯化石蠟暴露導(dǎo)致LysoPCs和LysoPEs含量的升高，可能是導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低的原因之一。此外，筆者前期的研究也觀察到SCCPs暴露顯著提高了磷脂酶A2(PLA2)的活性，該酶用于調(diào)節(jié)磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂，可引起HepG2細(xì)胞內(nèi)磷脂代謝的加強(qiáng)[24]。

2.5 對(duì)脂肪酸代謝的影響

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分，同時(shí)也是機(jī)體最大的儲(chǔ)能物質(zhì)。脂肪酸不能自由通過線粒體內(nèi)膜和過氧化物酶體膜，需要肉堿作為載體[25]。脂肪酸首先在脂酰輔酶A合成酶的作用下生成脂酰輔酶A，脂酰輔酶A與游離肉堿在脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶Ι的催化下生成脂酰肉堿，脂酰肉堿進(jìn)入線粒體和過氧化物酶體后在脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的作用下，重新釋放游離肉堿與脂酰輔酶A，從而進(jìn)行后續(xù)的脂肪酸氧化反應(yīng)。如圖5所示，在本研究中，短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)液中總脂肪酸(∑FFAs)、長(zhǎng)鏈脂肪酸(LC-FAs)、極長(zhǎng)鏈脂肪酸(VLC-FAs)、飽和脂肪酸(SFAs)和不飽和脂肪酸(USFAs)的含量均顯著升高，并且3個(gè)暴露組之間的脂肪酸水平?jīng)]有顯著差異。此結(jié)果說明，3種氯化石蠟對(duì)脂肪酸代謝具有相似的干擾效應(yīng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，3種氯化石蠟均顯著降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中游離肉堿的含量，提高了短、中和長(zhǎng)鏈脂酰肉堿的含量(SC-ACs、MC-ACs和LC-ACs)。這些結(jié)果說明，氯化石蠟暴露抑制了細(xì)胞的脂肪酸代謝[26-27]。這可能是因?yàn)槁然灡┞对鰪?qiáng)了脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶Ι的活性，但是抑制了脂酰肉堿轉(zhuǎn)移酶Ⅱ的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞游離肉堿含量降低，脂酰肉堿含量升高，總體上抑制了脂肪酸β氧化。

圖4 短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露對(duì)HepG2細(xì)胞磷脂代謝的影響注：C為對(duì)照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為L(zhǎng)CCPs暴露組；PCs表示磷脂酰膽堿，LysoPCs表示溶血磷脂酰膽堿，GP-C表示甘油磷脂膽堿，PEs表示磷脂酰乙醇胺，SIP表示1-磷酸鞘氨醇，LysoSM表示溶血鞘磷脂，SMs表示鞘磷脂，LysoPEs表示溶血磷脂酰乙醇胺；*和**分別表示與對(duì)照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 4 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on phospholipid metabolism of HepG2 cellsNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; PCs stands for phosphatidyl cholines; LysoPCs stands for lysophosphatidyl cholines; GP-C stands for glycerol-3-phosphocholine; PEs stands for phosphatidyl ethanolamines; SIP stands for sphingosine 1-phosphate; LysoSM stands for lysosphingomyelins; SMs stands for sphingomyelins; LysoPEs stands for lysophosphatidyl ethanolamines; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.

圖5 短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪酸代謝的影響注：C為對(duì)照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為L(zhǎng)CCPs暴露組；∑FFAs表示總脂肪酸，LC-FAs表示長(zhǎng)鏈脂肪酸，VLC-FAs表示極長(zhǎng)鏈脂肪酸，SFAs表示飽和脂肪酸，USFAs表示不飽和脂肪酸，F(xiàn)ree camitine表示游離肉堿，SC-ACs表示短鏈脂酰肉堿，MC-ACs表示中鏈脂酰肉堿；LC-ACs表示長(zhǎng)鏈脂酰肉堿；*和**分別表示與對(duì)照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 5 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on fatty acid metabolism of HepG2 cellsNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; ∑FFAs stands for total fatty acids; LC-FAs stands for long-chain fatty acids; VLC-FAs stands for very long-chain fatty acids; SFAs stands for saturated fatty acids; USFAs stands for unsaturated fatty acids; SC-ACs stands for short-chain acyl-carnitines; MC-ACs stands for medium-chain acyl-carnitines; LC-ACs stands for long-chain acyl-carnitines; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.

2.6 對(duì)氨基酸代謝的影響

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用。在本研究中，代謝通路富集分析揭示了3種氯化石蠟暴露對(duì)HepG2細(xì)胞氨基酸代謝的顯著影響。圖6顯示了12種差異氨基酸在胞外培養(yǎng)液中水平的變化情況。暴露24 h后，胞外培養(yǎng)液中總氨基酸含量顯著升高，并且短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露組中每一種差異氨基酸的含量變化趨勢(shì)一致。精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸為培養(yǎng)液中添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中只有蘇氨酸的含量是顯著降低的，其余均顯著升高。此結(jié)果表明，3種氯化石蠟暴露均抑制了細(xì)胞的氨基酸跨膜運(yùn)輸。LCCPs具有更強(qiáng)親脂性，可能更易與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性[28]，因而對(duì)氨基酸的跨膜運(yùn)輸產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效應(yīng)，并因此更強(qiáng)烈地干擾了氨基酸代謝(圖3)。細(xì)胞培養(yǎng)液中沒有添加谷氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸，檢測(cè)出的谷氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸為細(xì)胞合成物質(zhì)。如圖6所示，3種氯化石蠟暴露均引起了谷氨酸和鳥氨酸含量的顯著降低，瓜氨酸含量的變化不明顯，表明細(xì)胞內(nèi)的氨基酸合成代謝可能受到了抑制。

與人體內(nèi)暴露水平接近(100 μg·L-1)的短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露顯著降低了HepG2細(xì)胞的增殖活性，并且顯著干擾了細(xì)胞代謝。短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟均顯著影響了細(xì)胞的磷脂代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝。主要受干擾的代謝通路包括：甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝和鞘磷脂。短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟對(duì)磷脂代謝和脂肪酸代謝的擾亂程度相近，均加強(qiáng)了細(xì)胞磷脂代謝，抑制了脂肪酸的代謝。與SCCPs和MCCPs相比，LCCPs對(duì)氨基酸代謝產(chǎn)生了更強(qiáng)的干擾效應(yīng)。以上結(jié)果不支持MCCPs和LCCPs作為SCCPs的代替物使用。

圖6 短、中和長(zhǎng)鏈氯化石蠟暴露對(duì)HepG2細(xì)胞氨基酸代謝的影響注：C為對(duì)照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為L(zhǎng)CCPs暴露組；*和**分別表示與對(duì)照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 6 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on amino acid metabolism of HepG2 cellNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.