潘一帆，秦會，劉薇

大連理工大學環(huán)境學院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室，大連 116024

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)的生產(chǎn)和使用逐漸被禁止后，新型替代品用量顯著升高，目前已有超過3 000種全氟多氟化合物(per- and polyfluoroalkyl substances, PFASs)被投入全球市場[1-2]。新型替代品的環(huán)境效應(yīng)和健康風險未知，給PFASs的監(jiān)管帶來了極大的挑戰(zhàn)。氯代多氟醚基磺酸(chlorinated polyfluoroalkyl ether sulfonates, Cl-PFESAs)作為鉻霧抑制劑在中國使用長達30余年，因其與PFOS相似的化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，被視作PFOS的替代品[3]。初步研究發(fā)現(xiàn)，Cl-PFESAs具有肝臟毒性和發(fā)育毒性等有害效應(yīng)，有必要進行深入的毒理學研究，揭示其敏感作用靶點[4-6]。傳統(tǒng)的動物實驗無法針對大量的化學品開展高通量研究，且與人體健康效應(yīng)存在種間差異。因此，為揭示大量PFASs的毒性效應(yīng)與敏感靶點，亟需敏感可靠的高通量毒理學模型。

人源干細胞由于具有增殖分化潛能，且其分化過程良好地模擬了人體的生長發(fā)育，是一類研究化學品潛在發(fā)育毒性的適宜模型[7-8]。基于人體解剖和動物實驗的研究表明，PFASs可于骨骼中蓄積，這提示骨骼可能是PFASs的作用靶組織[9]。流行病學研究指出，暴露于PFASs與骨密度降低和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)[10-11]。因此，來源于人骨髓的間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)可能是PFASs的作用靶細胞。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PFOS暴露干擾了hBMSCs的成骨和成脂分化[12]。這些線索提示，hBMSCs是PFASs毒性靶點研究的一種靈敏、準確的毒理學模型。

轉(zhuǎn)錄組學分析是分子毒理學研究的重要手段，通常按照表達規(guī)律對基因進行富集歸類，然后對已分類基因開展功能或調(diào)控分析。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)基于多基因間的表達相關(guān)性，不僅可鑒定高度協(xié)同變化的基因模塊，同時也可根據(jù)基因模塊與特定性狀或表型之間的關(guān)聯(lián)鑒定生物標記基因和敏感靶點，廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)生與基因關(guān)聯(lián)分析，是篩選疾病治療靶點的出色工具[13]。本研究選擇hBMSCs體外模型，基于其基因表達譜，結(jié)合WGCNA方法探究Cl-PFESAs、PFOS、全氟己烷磺酸(perfluorohexane sulfonate, PFHxS)和全氟辛酸(perfluorooctanoic acid, PFOA)這4種PFASs暴露與特定基因模塊間的關(guān)聯(lián)，分析PFASs干擾的生物學過程和敏感靶基因。對PFOS和PFOA這2種全氟化合物已有較為深入的毒理學研究，而PFHxS和Cl-PFESAs則被選作2種代表性替代品。本研究將其與PFOS/PFOA暴露下細胞基因組學特征相比較，有利于預測和評估替代品的潛在毒性效應(yīng)及分子靶點，以期為該類化學品的毒理學研究、安全性評價與監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

工業(yè)級Cl-PFESAs產(chǎn)品購自上海中科合臣股份有限公司，該產(chǎn)品為8碳和10碳Cl-PFESA的混合物，商品名為F-53B(Cl(CF2)6O(CF2)2SO3K, CAS 73606-19-6)，純度大于98%。純度≥98% PFOS (C8F17KO3S)、純度為95% PFOA (C8F15KO2)和純度≥98% PFHxS (C6F13SO3K)購自Sigma-Aldrich。二甲基亞砜(DMSO)，純度大于99.5%，購自Panreac-Applichem(德國)。PFASs暴露液配制過程中均使用終濃度為0.1%的DMSO作為助溶劑。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

由廣州賽業(yè)生物提供的人骨髓間充質(zhì)干細胞，取自健康供體，細胞常規(guī)檢測結(jié)果表明，細菌、真菌和支原體顯陰性，內(nèi)毒素小于10 EU。細胞鑒定檢測結(jié)果表明，細胞復蘇貼壁率大于95.1%，可分化為成骨、成脂和成軟骨細胞。細胞表面標記分子檢測結(jié)果顯示，CD105、CD29、CD73和CD44呈陽性，CD34、CD45和CD11b呈陰性。

細胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，利用hBMSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物)進行培養(yǎng)及傳代。取第6代細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，1 d后將基礎(chǔ)培養(yǎng)基換為含100 nmol·L-1的Cl-PFESAs、PFOS、PFHxS或PFOA的暴露培養(yǎng)基，以及含0.1% DMSO的溶劑對照培養(yǎng)基，持續(xù)暴露7 d，每2～3天更換培養(yǎng)基。

1.3 細胞RNA抽提、純化和芯片檢測

暴露7 d后，利用TRIzol(Life technologies，美國)抽提細胞總RNA。利用核酸定量儀測定RNA純度和濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳判斷質(zhì)量，然后進行芯片檢測。芯片雜交和掃描由上海伯豪生物公司完成。芯片雜交按照Affymetrix表達譜芯片(美國)的標準流程進行，使用GeneChip?Hybridization和Wash and Stain Kit試劑盒(Affymetrix)，在滾動雜交爐(Hybridization Oven 645, Affymetrix)中45 ℃滾動雜交16 h，雜交完成后在洗滌工作站(Fluidics Station 450, Affymetrix)進行芯片的洗滌。掃描芯片結(jié)果(GeneChip?Scanner 3000, Affymetrix)，用Command Console Software 4.0 (Affymetrix)讀取原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)已上傳于GEO數(shù)據(jù)庫(GSE115836)。芯片測試共分為5組(DMSO溶劑對照組、Cl-PFESA暴露組、PFOS暴露組、PFHxS暴露組和PFOA暴露組)，每組3個平行。

1.4 加權(quán)基因網(wǎng)絡(luò)共表達分析

利用R語言軟件包WGCNA，按照默認參數(shù)構(gòu)建加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)，篩選代表性PFASs共同影響的生物學功能和敏感靶基因[13]。首先對芯片中總計49 293個探針進行初步篩選，排除多個探針對應(yīng)同一基因的情況，共獲得20 014個基因。為篩選差異表達倍數(shù)差異較高的基因，計算了15個細胞樣本中20 014個基因各自差異表達倍數(shù)的方差，并選取方差較大的前25%的基因，共得到了5 004個基因用于后續(xù)分析[14-15]。對樣本進行皮爾遜相關(guān)性分析，篩查是否存在離群樣本。確保不存在離群樣本后，在基因間進行皮爾遜相關(guān)性分析，按照無尺度網(wǎng)絡(luò)標準構(gòu)建鄰接矩陣。為降噪和更好地衡量基因網(wǎng)絡(luò)連通性，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓撲重疊矩陣。然后利用動態(tài)剪切枝法劃分基因模塊，并將相似分支進行合并。

1.5 基因模塊與PFASs暴露相關(guān)性分析

為探究哪些基因模塊與PFASs暴露存在關(guān)聯(lián)，計算模塊特征向量(module eigengene, ME)，并利用ME計算基因模塊與溶劑對照組以及PFASs暴露組細胞基因表達譜間的相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient,r)，將P≤0.05定義為顯著相關(guān)。

1.6 基因模塊功能注釋與樞紐基因篩選

提取基因模塊中的基因，利用Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery(DAVID)進行功能注釋[16]，并利用cytoscape對WGCNA構(gòu)建的包含PFASs潛在靶點的基因共表達網(wǎng)絡(luò)進行可視化，依據(jù)連通性篩選網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PFASs作用下hBMSCs的基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用15個細胞樣本方差前25%的5 004個基因構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)。首先用flashclust函數(shù)執(zhí)行層次聚類分析，無明顯離群值。按無尺度網(wǎng)絡(luò)標準建立臨近矩陣，為使網(wǎng)絡(luò)節(jié)點連接度的對數(shù)與該節(jié)點出現(xiàn)概率的對數(shù)相關(guān)系數(shù)≥0.9(圖1(a))，計算確認臨近函數(shù)加權(quán)參數(shù)，可得軟閾值(β)為16，進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到14個模塊(圖1(b))，此外有938個基因未能分配到任何一個模塊(灰色)。隨后對14個模塊進行層次聚類分析(圖1(c))，判別不同基因模塊間的關(guān)聯(lián)。

圖1 軟閾值確定(a)、基因聚類樹和模塊顏色劃分(b)和模塊聚類分析(c)Fig. 1 Identification of soft threshold (a), clustering dendrograms of genes together with assigned module colors (b) and module cluster analysis (c)

2.2 基因模塊與PFASs暴露的相關(guān)性分析

對基因模塊和PFASs暴露組樣本進行相關(guān)性分析，溶劑對照組與Brown(r=0.63,P=0.01)、Greenyellow(r=0.66,P=0.001)和Blue模塊(r=0.66,P=0.007)顯著正相關(guān)(圖2)。Cl-PFESA暴露組與Greenyellow模塊顯著負相關(guān)(r=-0.61,P=0.02)，PFOS暴露組與Blue模塊顯著負相關(guān)(r=-0.62,P=0.01)。PFOA和PFHxS暴露組與Greenyellow和Blue模塊無顯著相關(guān)性。這表明，PFASs暴露組中Brown、Greenyellow和Blue模塊基因表達模式與對照組有較大差異，提示相關(guān)模塊中基因調(diào)控的生物學過程可能受到4種PFASs的影響，且模塊中可能包含4種PFASs共同作用的靶基因。此外，聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，black模塊和red模塊相關(guān)度較高(圖1(b))，并與PFOS暴露顯著正相關(guān)(圖2)，提示其調(diào)控的生物學過程可能受到PFOS的干擾。

圖2 基因模塊與全氟多氟化合物(PFASs)暴露細胞樣本間的相關(guān)系數(shù)注：Cl-PFESAs表示氯代多氟醚基磺酸，PFHxS表示全氟己烷磺酸，PFOS表示全氟辛烷磺酸，PFOA表示全氟辛酸；* P≤0.05，顯著相關(guān)。Fig. 2 Correlation coefficients between modules and per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) exposed samplesNote: Cl-PFESAs, chlorinated polyfluoroalkyl ether sulfonates; PFHxS, perfluorohexane sulfonate; PFOS, perfluorooctane sulfonate; PFOA, perfluorooctanoic acid; *significance of correlation at P≤0.05 level.

2.3 PFASs影響基因模塊的生物學功能分析

為了解每個模塊所表征的生物學功能，筆者提取了每個模塊中的基因，并利用DAVID進行生物學過程富集分析。每個模塊中最顯著的3個生物學過程如圖3所示。Greenyellow模塊中顯著富集“骨髓白細胞分化負調(diào)控”以及“嘧啶和嘌呤核苷酸的代謝過程”，提示PFASs可能干擾核酸代謝以及免疫細胞分化。與PFOS暴露顯著相關(guān)的Red和Black模塊中分別富集出與糖酵解和線粒體氧化磷酸化相關(guān)的生物學過程，提示PFOS可能影響細胞呼吸過程。Blue模塊中富集出蛋白質(zhì)合成的tRNA氨?；约澳懝檀己彤愇於┑纳锖铣桑崾綪FASs可能干擾蛋白質(zhì)合成以及脂質(zhì)代謝等。此外，在Blue模塊中顯著富集出“成骨分化”，提示PFASs對hBMSCs成骨分化的干擾作用。Brown模塊中顯著富集“骨化”，并且與PFOS顯著相關(guān)的Tan模塊中顯著富集出“成骨分化正調(diào)控過程”，進一步提示PFASs對骨形成的干擾作用。

2.4 識別PFASs暴露干擾的模塊樞紐基因

由于Blue模塊中顯著富集出與脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物學過程，而干擾脂質(zhì)代謝是PFASs的主要毒性效應(yīng)之一[17]，因此，進一步探究PFASs影響的Blue模塊的基因共表達，以及篩選樞紐基因。利用WGCNA輸出的模塊網(wǎng)絡(luò)文件結(jié)合Cytoscape的Blue模塊基因共表達網(wǎng)絡(luò)圖(基因節(jié)點間權(quán)重>0.1)，并根據(jù)連通性篩選樞紐基因(圖4)。在Blue模塊中，連通性最高的4個樞紐基因分別為Delta(24)-sterol reductase (DHCR24)、Squalene monooxygenase (SQLE)、Laminin subunit alpha-1 (LAMA1)、3-beta-hydroxysteroid-delta(8), delta(7)-isomerase (EBP)。這4個樞紐基因均顯著下調(diào)(P≤0.5)(表1)。

圖4 Blue模塊基因共表達網(wǎng)絡(luò)圖注：SQLE表示樞紐基因鯊烯環(huán)氧酶，LAMA1表示樞紐基因?qū)诱尺B蛋白α1亞基，DHCR24表示樞紐基因24-脫氫膽固醇還原酶，EBP表示樞紐基因甾醇δ異構(gòu)酶；基因節(jié)點大小、顏色與基因節(jié)點連通性呈正相關(guān)。Fig. 4 Gene co-expression network of Blue moduleNote: SQLE, squalene monooxygenase; LAMA1, hub gene laminin subunit alpha-1; DHCR24, hub gene delta(24)-sterol reductase; EBP, hub gene 3-beta-hydroxysteroid-delta(8), delta(7)-isomerase; size and color of gene node positively correlate with connectivity of gene node.

3 討論(Discussion)

利用WGCNA分析了4種PFASs暴露所影響的hBMSCs的關(guān)鍵生物學過程，并通過篩選相應(yīng)生物學過程中的樞紐基因識別靶標基因。

基于PFASs暴露后hBMSCs的基因表達譜信息構(gòu)建的14個基因模塊中，Brown、Blue和Greenyellow模塊中的基因表達模式在PFASs暴露組細胞中與對照組間存在較大差異。Greenyellow模塊中富集的最顯著的生物學過程是骨髓白細胞分化的負調(diào)控。Brieger等[18]研究了PFOS和PFOA體外暴露對人外周白細胞的影響，發(fā)現(xiàn)PFOA顯著增強了骨化三醇誘導的HL-60細胞株的單核細胞分化，并增加了巨噬細胞IL-6和TNF-α的釋放，而在脂多糖刺激后PFOS暴露降低了促炎細胞因子TNF-α的釋放。此外，Corsini等[19]發(fā)現(xiàn)全氟丁烷磺酸(perfluorobutane sulfonic acid, PFBS)、全氟癸酸(perfluorodecanoic acid, PFDA)、PFOS和氟調(diào)聚醇(fluorotelomer, 8:2 Telomer)均抑制了脂多糖誘導的TNF-α生成。動物實驗和流行病學研究均已發(fā)現(xiàn)PFOS等全氟烷酸化合物暴露與免疫功能異常之間的關(guān)聯(lián)[17]，但目前尚無關(guān)于Cl-PFESA等新型替代品的免疫毒理學研究。本研究通過PFASs對轉(zhuǎn)錄組的影響和WGCNA分析，證明免疫功能是PFASs毒性效應(yīng)的敏感靶標。骨髓是人體重要的免疫器官，hBMSCs在調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境及其免疫功能中起到關(guān)鍵作用[20]。因此，以hBMSCs為毒理學研究模型，對于揭示免疫干擾作用和機制具有重要意義。

Blue模塊中最顯著富集的生物學過程為膽固醇生物合成。此外，其基因共表達網(wǎng)絡(luò)中連通性最高的樞紐基因DHCR24、SQLE和EBP均與脂質(zhì)代謝相關(guān)。DHCR24可催化甾醇中間體δ-24雙鍵的還原，此外還可通過降低氧化應(yīng)激誘導的細胞凋亡過程中caspase 3的活性來保護細胞免受氧化損傷[21]。只要上游膽固醇合成過程未被完全抑制，DHCR24下調(diào)很可能導致膽固醇累積[22]。SQLE可催化甾醇生物合成中的第一個氧化步驟，是該途徑的限速酶之一，研究表明SQLE受到影響可干擾膽固醇穩(wěn)態(tài)[23]。EBP可催化δ(8)-甾醇轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的δ(7)-異構(gòu)體[24]。PFASs暴露導致以上幾個基因表達下調(diào)，為進一步驗證DHCR24、SQLE和EBP為PFASs作用的潛在敏感靶基因，本研究利用比較毒理組學數(shù)據(jù)庫對PFOS和PFOA的互作基因進行了檢索[25]。結(jié)果表明，PFOA的2 731個互作基因和PFOS的2 001個互作基因中包含本研究富集出的膽固醇的生物合成過程14個基因中的13個，并且在PFOS和PFOA互作基因中都包含EBP和SQLE，而DHCR24包含于PFOA互作基因中。此外，來源于大鼠[26]、小鼠[27]和人肝癌細胞[28]等體內(nèi)體外模型的研究表明，PFOS或PFOA可干擾DHCR24、SQLE和EBP基因或蛋白的表達，變化趨勢與暴露模式和受試生物的種類有關(guān)。比較毒理組學數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果均支持本研究利用WGCNA分析hBMSCs基因組數(shù)據(jù)識別出的樞紐基因。

表1 PFASs暴露對Blue模塊中樞紐基因表達水平的影響Table 1 Effects of PFASs exposure on hub genes expression from Blue module

PFASs干擾嚙齒類動物脂質(zhì)代謝過程的主要機制是激活PPARα這一脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子[17,29]。在脂肪干/祖細胞中，PFASs主要通過激活PPARγ促進細胞成脂分化[5,30]。hBMSCs是脂肪細胞和成骨細胞共同的祖細胞，其成骨成脂分化平衡異常與代謝疾病和發(fā)育相關(guān)疾病密切相關(guān)[31]。與PFOS顯著相關(guān)的Tan模塊中“成骨分化正調(diào)控過程”顯著富集(r=0.51,P=0.05)，并且Blue和Brown模塊中分別顯著富集“成骨分化”和“骨化”，提示PFOS可干擾成骨/成脂分化平衡。前期筆者在基于細胞分化的分子標志物和表型標志物的研究中，發(fā)現(xiàn)PFOS在人體暴露相關(guān)濃度下即可促進hBMSCs成脂分化并抑制其成骨分化，部分原因可能是由于PFOS對Wnt信號通路的干擾，但可能仍存在其他機制，需要更深入研究[12]。而本研究結(jié)果提示，若繼續(xù)探究PFASs干擾成骨或成脂分化的機制，可圍繞本研究識別的相關(guān)樞紐基因展開?；趆BMSCs基因表達譜的WGCNA分析，有助于識別PFASs毒性作用敏感靶標，揭示PFASs干擾脂質(zhì)代謝的分子機理。

綜上，本研究基于hBMSCs的基因表達譜，利用WGCNA方法對4種典型PFASs毒性作用干擾的敏感生物學過程和靶基因進行了篩選，發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)控和脂質(zhì)代謝是PFASs的敏感靶標，DHCR24、SQLE和EBP可能是PFASs干擾脂質(zhì)代謝的敏感靶基因。可進一步利用hBMSCs體外模型研究PFASs的相關(guān)毒性作用和機制，有助于建立該類化學物毒性預測和篩選的生物標志物，為其安全性評價和監(jiān)管提供科學依據(jù)和新方法。