袁琳琳，喻曉芬

（浙江省人民醫(yī)院 手術(shù)室，浙江 杭州 310014）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其癥狀隱匿，在初次被發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，嚴重威脅患者健康[1]。對于中晚期HCC患者，目前能夠顯著延長患者總體生存期的靶向治療藥物依然有限，因此這類患者的總體預(yù)后依然較差[2]。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸引起重視[3]。miRNA能夠結(jié)合在下游靶基因的3’端非編碼區(qū)，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或翻譯受阻，從而抑制靶基因的表達，發(fā)揮調(diào)控腫瘤細胞增殖、運動、耐藥性等生物學(xué)功能[4]。大量研究表明，多種miRNA在HCC中存在異常表達，并且與HCC患者的臨床病理特征及預(yù)后具有顯著相關(guān)性[5]。miR-202近來被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中存在異常表達，其在胃癌[6]、骨肉瘤[7]及胰腺癌[8]中存在低表達，能夠抑制腫瘤細胞的增殖，從而發(fā)揮抑癌作用。有研究表明miR-202在HCC組織中低表達，且能抑制HCC細胞的增殖[9]。然而，miR-202對HCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用目前仍不明確。本研究擬通過Transwell實驗和Western blot實驗探明miR-202對HCC細胞遷移侵襲能力以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并進一步檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-202在HCC細胞中的作用靶點，利用Western blot及熒光素酶實驗證實miR-202對下游靶點的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌細胞系（Hep3B、Huh7、HCCLM3細胞）及永生化的正常肝細胞LO2購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），并在液氮中長期凍存。本實驗所用細胞均利用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素購自美國Gibico公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；miR-202模擬物（miR-202 mimic）和miRNA空白對照（miRNA control，miR-control）、miR-202抑制物（miR-202 inhibitor）和miRNA陰性對照（miRNA negative control，miR-NC）、野生型Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1，ROCK1）3’-UTR質(zhì)粒和突變型ROCK13’-UTR質(zhì)粒購自廣州市銳博生物科技有限公司；Transwell孔板購自美國Corning公司；兔抗GAPDH抗體、兔抗E-cadherin抗體、鼠抗N-cadherin抗體、鼠抗ROCK1抗體購自美國Cell Signaling公司；HRP標記的山羊抗鼠/兔二抗購自北京蘭博利德公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：提取凍存于液氮的HCC細胞系及LO2細胞，置于37 ℃水浴箱快速解凍后，加入5 mL無血清DMEM培養(yǎng)基，1000 r/min離心5 min后，棄去上清，利用10 mL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸后，接種于細胞培養(yǎng)皿，置于37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換細胞培養(yǎng)基，每日觀察細胞生長狀況。當細胞融合度達50%～70%時，根據(jù)Lippofectamine2000試劑盒說明書將miR-202 mimic、miR-control、miR-202 inhibitor及miR-NC終濃度調(diào)整為5 mmol/L后，加入6孔板細胞中，培養(yǎng)24 h后，更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，48 h后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，并將細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 Transwell實驗：將HCCLM3細胞分為HCCLM3空白對照組和miR-202過表達組，將Hep3B細胞分為Hep3B陰性對照組和miR-202敲低組。胰酶消化上述細胞后，利用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞密度調(diào)整至1×106/mL備用。向Transwell孔板（24孔）的實驗孔中加入700 μL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；向Transwell小室中加入200 μL上述備用細胞懸液，并將盛有細胞懸液的Transwell小室置于含有培養(yǎng)基的實驗孔中；將上述Transwell孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉簽擦去小室薄膜上層細胞后，結(jié)晶紫染色薄膜下層細胞后，置于顯微鏡下計數(shù)拍照。對于侵襲能力檢測，在向Transwell小室接種細胞懸液前，在每個小室膜上滴加70 μL利用DMEM稀釋的基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠固化后再接種細胞，其余步驟同上。

1.2.3 實時定量PCR：使用Trizol提取細胞內(nèi)RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用熒光定量PCR試劑盒檢測細胞內(nèi)miR-202及ROCK1 mNRA的表達；分別用U6和GAPDH作為miR-202及ROCK1的內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測細胞內(nèi)ROCK1及GAPDH蛋白的表達：使用RIPA裂解液提取細胞內(nèi)的蛋白，細胞充分裂解后，14000 r/min離心15 min后，去蛋白上清，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度；SDS-PAGE膠的上樣孔中每孔加入50 μg蛋白樣品，電泳分離蛋白后，采用半干轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，20 V轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入ROCK1抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃冰箱孵育過夜后，TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min，分別加入山羊抗兔或鼠IgG二抗（1∶5000），室溫孵育1 h TBST緩沖液漂洗3次，每次5 min。暗室中，在膜上滴加ECL發(fā)光液顯影。

1.2.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩ep3B細胞分為如下8組：miR-control與野生型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-202 mimic與野生型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-NC與野生型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-202 inhibitor與野生型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-control與突變型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-202 mimic與突變型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-NC與突變型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，miR-202 inhibitor與突變型ROCK13’-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。共轉(zhuǎn)染完成后48 h收集細胞。按雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作，用熒光檢測儀檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 利用GraphPad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-202在肝癌細胞系中低表達 與永生化的正常肝細胞LO2相比，3種肝癌細胞Hep3B、Huh7、HCCLM3細胞中miR-202的表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。在3種HCC細胞中，miR-202在Hep3B中的表達水平最高，而在HCCLM3細胞中的表達水平最低。因此，本研究選擇Hep3B細胞進行miR-202的敲低實驗，選擇HCCLM3細胞進行miR-202的過表達實驗。

圖1 miR-202在3種肝癌細胞及正常肝細胞LO2中的表達

2.2 HCCLM3細胞中過表達miR-202 與miR-control組比，轉(zhuǎn)染miR-202 mimic可顯著增加HCCLM3細胞中的miR-202表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.00±0.05 vs. 8.99±1.25，P＜0.01）。

2.3 過表達miR-202降低HCCLM3細胞的遷移和侵襲能力 Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：過表達miR-202后，HCCLM3的遷移能力顯著降低（P＜0.05）；侵襲實驗結(jié)果顯示：過表達miR-202后，HCCLM3的侵襲能力顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 Hep3B細胞中敲低miR-202 與miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-202 inhibitor可顯著降低Hep3B細胞中的miR-202表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.00±0.06 vs.0.12±0.02，P＜0.01）。

2.5 敲低miR-202增強Hep3B細胞的遷移和侵襲能力 Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：敲低miR-202后，Hep3B細胞的遷移能力顯著降低（P＜0.05）；侵襲實驗結(jié)果顯示：敲低miR-202后，Hep3B細胞的侵襲能力顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

2.6 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測和熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-202靶基因為ROCK1 通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan，miR-202可能的靶基因為ROCK1。miR-202與ROCK1的3’-UTR間存在互補配對序列（見圖4A）。進一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達miR-202后，野生型ROCK13’-UTR組細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；敲低miR-202后，野生型ROCK13’-UTR組細胞熒光素酶活性顯著增加（P＜0.05）；過表達或敲低miR-202對突變型ROCK13’-UTR組細胞熒光素酶活性沒有顯著影響。見圖4B。

圖3 敲低miR-202增強Hep3B細胞的遷移（A）及侵襲（B）能力

圖4 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測及miR-202調(diào)控ROCK13’-UTR的熒光素酶活性

2.7 過表達miR-202后HCCLM3細胞ROCK1表達降低 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-202 mimic組HCCLM3細胞中ROCK1 mRNA水平較miR-control組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A；Western blot結(jié)果表明，過表達miR-202后HCCLM3細胞中ROCK1蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5B。

2.8 敲低miR-202后HCCLM3細胞ROCK1表達增加實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-202 inhibitor組Hep3B細胞中ROCK1 mRNA水平較miR-NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6A；Western blot結(jié)果表明，過表達miR-202后HCCLM3細胞中ROCK1蛋白表達水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6B。

3 討論

miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用近年來逐漸引起關(guān)注[10]。多種miRNA，如miR-7[11]、miR-92a[12]及miR-122[13]等被發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中存在異常表達，且與肝癌患者的臨床病理特征及預(yù)后具有顯著相關(guān)性。因此，miRNA已被作為肝癌患者診斷及預(yù)后評估的潛在生物學(xué)標志物，并有望成為肝癌治療的新靶點。miR-202是近來被發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤中存在異常表達的miRNA。研究數(shù)據(jù)顯示：miR-202在胃癌[6]、骨肉瘤[7]及胰腺癌[8]中存在低表達，能夠抑制腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌作用。然而，miR-202對肝癌細胞的影響，尤其是遷移和侵襲能力的影響，目前仍不明確。

圖5 實時定量PCR（A）和Western blot（B）檢測過表達miR-202對ROCK1表達的影響

圖6 實時定量PCR（A）和Western blot（B）檢測敲低miR-202對ROCK1表達的影響

基于上述研究背景，本研究利用qRT-PCR、Western blot、Transwell實驗以及熒光素酶報告基因等分子生物學(xué)技術(shù)手段探明miR-202對肝癌細胞遷移及侵襲能力的影響及可能分子機制。本研究結(jié)果表明：miR-202通過抑制肝癌細胞的侵襲能力，在肝癌病情進展中發(fā)揮抑癌作用。本研究進一步通過對生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan檢索發(fā)現(xiàn)，ROCK1基因的3’-UTR含有與miR-202的互補配對序列，可能是miR-202的靶基因。進一步利用熒光素酶實驗證實miR-202能夠與ROCK13’-UTR結(jié)合，表明ROCK1是miR-202的靶基因。qRT-PCR及Western blot實驗表明：miR-202能夠抑制細胞ROCK1的表達。值得關(guān)注的是：骨肉瘤中的研究顯示Gli2蛋白是miR-202的靶基因[7]；而在胰腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-202可調(diào)控細胞內(nèi)Mxd1和Sin3A的表達[8]。這些研究結(jié)果表明：miR-202在不同的腫瘤中具有不同的下游靶點。miR-202在肝癌中是否具有其他的下游作用靶點仍需進一步研究。

本研究所發(fā)現(xiàn)的miR-202的下游靶基因即ROCK1基因，是ROCK家族的一員，在多種腫瘤中高表達，并對腫瘤細胞的運動能力具有直接調(diào)控作用[14]。乳腺癌中的研究表明：miR-340通過抑制ROCK1的表達，發(fā)揮對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用[15]。膀胱癌中的研究表明：miR-1280通過抑制ROCK1的表達，發(fā)揮對膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用[16]。上述既往研究結(jié)果表明：ROCK1是多種miRNA的下游靶點。

綜上所述，miR-202在肝癌細胞中呈顯著低表達，能夠抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；miR-202能夠與ROCK13’-UTR結(jié)合，抑制肝癌細胞內(nèi)ROCK1的表達。因此，miR-202可能通過抑制ROCK1的表達發(fā)揮對肝癌細胞遷移和侵襲的抑制作用。miR-202有望成為肝癌診斷及預(yù)后評估的新生物學(xué)標志物，可能成為肝癌治療的新靶點。