宋永學(xué) 李季生 高妍夏 賈漫麗 李 娜 楊貴明

(河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北承德 067000)

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)是桑黃的一種，主要寄生于桑樹等樹種的活立木上，屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes)，繡革孔菌目(Hymenochaetales)，繡革孔菌科(Hymenochaetaceae)，纖孔菌屬(Inonotus)[1]，藥用價(jià)值很高，民間被用于治療各種疑難疾病，如各種癌癥、糖尿病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、咳嗽、消化不良[1-2]等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，粗毛纖孔菌的子實(shí)體含有豐富的多糖、多酚、三萜類物質(zhì)和其它活性物質(zhì)[3-7]，抗腫瘤效果明顯[8]，甚至超過火木層孔菌 (Phellinusigniarius)和木蹄層孔菌(Fomesfomentarius) 兩種桑黃[9]。另外，有研究表明粗毛纖孔菌在增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抑菌、抗病毒和降血糖等方面也有顯著功效[10-12]。

目前，關(guān)于粗毛纖孔菌人工栽培的報(bào)道很少[13-14]。我們從2013年開始研究粗毛纖孔菌的人工培養(yǎng)，但存在出菇率和產(chǎn)量低的問題，而且大部分子實(shí)體分化不完全，不能分化出如野生子實(shí)體的菌蓋和菌孔，以致品質(zhì)較差。研究中發(fā)現(xiàn)，用不同粗毛纖孔菌子實(shí)體的孢子分離培養(yǎng)的菌株，進(jìn)行人工培養(yǎng)時(shí)在出菇率、子實(shí)體形狀、產(chǎn)量等方面存在較大差異，部分菌株在產(chǎn)量和品質(zhì)方面明顯優(yōu)于其它菌株。因此在研究栽培技術(shù)的同時(shí)，篩選優(yōu)良菌株具有十分重要的意義。本研究通過對(duì)大量菌株栽培試驗(yàn)，進(jìn)行相關(guān)性狀比較，以篩選出適合人工栽培的優(yōu)良菌株。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

來源包括：采摘自承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所桑園和承德避暑山莊老桑樹上的粗毛纖孔菌子實(shí)體，通過組織分離法或孢子分離法得到的1代菌株，從1代菌株培養(yǎng)的子實(shí)體用孢子分離法得到2代菌株，總數(shù)有30多個(gè)，但大部分在母種培養(yǎng)階由于菌絲長勢(shì)太弱而在第1輪篩選中淘汰，用作出菇試驗(yàn)的菌株只有10個(gè)，編號(hào)分別為：826-3、826-4、919-1、1013-1、1013-2、1013-3、1013-6、1031-1、1031-2、1018-3；另有引自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)的原寄生于蒙古黃榆上的粗毛纖孔菌(編號(hào)JLHY)。

1.2 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)。

原種培養(yǎng)基為谷粒培養(yǎng)基(谷粒98%，碳酸鈣1%，石膏1%；含水量約60%)。

栽培種培養(yǎng)基：一年生桑枝粉60%，棉籽殼30%，麥麩8%，蔗糖1%，石膏1%；含水量60%。

1.3 試驗(yàn)方法

組織分離法、母種培養(yǎng)和原種培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)[15]。

1.3.1 多孢子分離培養(yǎng)

選取生長成熟、個(gè)大健壯、剛開始彈射孢子的粗毛纖孔菌子實(shí)體，在超凈工作臺(tái)上懸掛于玻璃鐘罩內(nèi)，鐘罩倒扣在消毒過的培養(yǎng)皿上方， 1～2天后即可完成孢子彈射分離。將彈射出的孢子粉用無菌水稀釋，接種于裝有PDA培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)子實(shí)體產(chǎn)生的孢子粉接3～5個(gè)培養(yǎng)瓶。菌絲長出后，選取萌發(fā)快、長勢(shì)好、無污染的菌絲塊接入PDA試管培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)瓶接3～5個(gè)試管，根據(jù)生長發(fā)育情況選出菌絲生長最快的試管作為備選菌株。

1.3.2 栽培種培養(yǎng)

栽培種菌袋選用聚丙烯栽培袋(17 cm × 35 cm)，每袋干料約450 g，含水量約10%，折算干物質(zhì)405 g。裝料后在中間插入長20 cm的打孔棒，消毒后在打孔處分上中下三處接入原種，每個(gè)菌株接種10袋，然后置于培養(yǎng)室內(nèi)黑暗培養(yǎng)，保持溫度26～28 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。記錄菌絲長滿菌袋時(shí)間。

1.3.3 出菇管理

待菌絲長滿菌袋后再培養(yǎng)10 d使菌絲吃料完全，然后轉(zhuǎn)入出子實(shí)體培養(yǎng)室，袋口向上擺放，25～28 ℃見光培養(yǎng)，空氣相對(duì)濕度60%～70%。10天后開口，即在菌袋的肩部或出現(xiàn)子實(shí)體原基處用刀劃一個(gè)(4～5) cm×1 cm的橫向小口，此后控制空氣相對(duì)濕度在85%～93%，并保持適當(dāng)通風(fēng)，光照為自然散射光，光強(qiáng)度<1000 lx。

1.3.3 調(diào)查項(xiàng)目

包括自接種至菌絲長滿菌袋的時(shí)間、出菇率(即菌袋長出子實(shí)體的比例)、野生形子實(shí)體(有明顯菌蓋和菌孔)比例、單袋產(chǎn)量(即每個(gè)菌袋子實(shí)體產(chǎn)量，以干重計(jì))、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率及其它外觀表現(xiàn)性狀。

粗毛纖孔菌子實(shí)體的生物轉(zhuǎn)化率=單袋產(chǎn)子實(shí)體總干質(zhì)量/單袋培養(yǎng)料干質(zhì)量×100%

1.3.4 ITS基因測(cè)序分析

將試驗(yàn)中性狀表現(xiàn)差異較大的4個(gè)菌株(826-4、1012-6、1018-3、1031-2)的子實(shí)體和2個(gè)野生粗毛纖孔菌子實(shí)體【包括從承德避暑山莊采集的(編號(hào)2015SZ)和承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所老桑園內(nèi)采集的(編號(hào)2015T)】進(jìn)行ITS基因測(cè)序分析。

測(cè)序方法：取桑黃子實(shí)體菌蓋組織，放入組織研磨破碎儀破碎。按照文獻(xiàn)[16]中CTAB法提取桑黃的DNA。

引物序列ITS：5F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)，4R(TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR)。擴(kuò)增體系：2xPCR Mix 12.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 1 μL， ddH2O 11.1 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間逐漸增加3 s)，最終72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行測(cè)序。

另外從NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)下載三份粗毛纖孔菌基因序列(登記號(hào)分別為EU918123.1、KX881611.1、FR686562.1)，使用DNAMAN6.0軟件與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長速度比較

從表1可見，由于采用上中下三段式接種，菌絲從不同部位由內(nèi)而外長出，除JLHY滿袋時(shí)間為28 d，顯著長于其它菌株外，其余菌株滿袋時(shí)間均為18～20 d，菌株之間無顯著差異。

表1 不同菌株菌絲及子實(shí)體生長情況比較

注：表中小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。

2.2 出菇率及野生形子實(shí)體比例比較

從表1可見，不同菌株出菇率方面差別較大，826-4、826-3、1018-3、1031-2出菇率均為100%，其中826-4和1018-3出菇最快，出菇整齊，子實(shí)體均為野生形狀，826-3出菇整齊度稍差，子實(shí)體90%為野生形狀；JLHY多次開口均未有子實(shí)體生長；其它菌株出菇率從80%到50%不等，有許多是在第2次或第3次開口后才長出子實(shí)體，野生形子實(shí)體的比例差異也較大，從25%到75%不等。

2.3 子實(shí)體產(chǎn)量比較

從表1可見，不同菌株子實(shí)體產(chǎn)量差異較大，其中以826-4產(chǎn)量最高，平均每袋產(chǎn)子實(shí)體干質(zhì)量為33.40 g，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率達(dá)到8.25%，826-3和1018-3次之。因同一菌株內(nèi)菌袋間產(chǎn)量相差較大，且有不少菌袋未長出子實(shí)體，導(dǎo)致一些菌株間差異顯著性并不明顯。

2.4 外觀表現(xiàn)

在母種培養(yǎng)和原種培養(yǎng)兩個(gè)階段的后期，1018-3的菌絲顏色比其它菌株都明顯要淺很多，為鮮嫩的白色至淺黃色，而其它菌株則為黃色至棕黃色。

在開口前的見光培養(yǎng)期間，826-4和826-3大部分會(huì)形成明顯的略向外凸起的子實(shí)體原基，而在此處開口則會(huì)很快形成野生形的子實(shí)體，此特征以826-4更為明顯，而其它菌株在此期間基本不會(huì)形成明顯的子實(shí)體原基。

在出菇培養(yǎng)階段，1018-3出菇速度最早，出菇培養(yǎng)第2天就形成明顯的菌蕾。另外，部分1018-3子實(shí)體發(fā)育時(shí)，會(huì)形成沒有明顯菌蓋、表面全是菌孔的猴頭狀子實(shí)體，其它菌株均無此現(xiàn)象。

2.5 ITS基因測(cè)序分析結(jié)果

6個(gè)粗毛纖孔菌菌株的ITS基因序列和下載到的三份其它粗毛纖孔菌的ITS基因序列的對(duì)比圖見圖1，粗毛纖孔菌ITS基因序列同源樹的構(gòu)建見圖2。

由圖1和圖2可以看出，6個(gè)菌株間幾乎沒有差異，與其它三份ITS基因序列差異也很小，說明它們同屬于粗毛纖孔菌(Inonotus hispidus)，并且相互之間親緣關(guān)系很近。

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，粗毛纖孔菌不同菌株間存在顯著差異，但此差異并沒有體現(xiàn)在ITS基因序列上。

野生形子實(shí)體比例體現(xiàn)該菌株的子實(shí)體的總體品質(zhì)，從結(jié)果看，其高低與該菌株的平均產(chǎn)量是相關(guān)的，因此野生形子實(shí)體比例應(yīng)做為篩選優(yōu)良菌株的重要性狀。

菌袋開口之前形成子實(shí)體原基，對(duì)于確定適宜的開口時(shí)間和開口位置十分重要，是一個(gè)可指導(dǎo)生產(chǎn)的好性狀。

粗毛纖孔菌母種和原種期間的菌絲顏色在一定程度上可體現(xiàn)菌絲的活力，顏色越淺活力越強(qiáng)，1018-3在母種和原種培養(yǎng)后期顏色明顯較其它菌株淺，而在出菇培養(yǎng)時(shí)出菇最早，若此二性狀關(guān)聯(lián)，則可在菌株篩選時(shí)，通過比較母種和原種期間菌絲顏色進(jìn)行初選。

圖1 ITS基因序列對(duì)比圖

圖2 ITS基因序列同源樹

本次試驗(yàn)中，引自吉林的原寄生于蒙古黃榆的粗毛纖孔菌菌株未能生長子實(shí)體，因未進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，還不能確定是否為菌種的原因。

綜上所述，粗毛纖孔菌優(yōu)良菌株的篩選，對(duì)提高人工栽培中的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。試驗(yàn)中篩選出的826-4和1018-3，在產(chǎn)量和品質(zhì)方面表現(xiàn)較好，優(yōu)勢(shì)突出，且在后續(xù)的栽培試驗(yàn)中也表現(xiàn)穩(wěn)定，可以作為優(yōu)良菌株進(jìn)行中試試驗(yàn)。