路 康, 王森山

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室， 甘肅 蘭州730070)

豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)是危害豌豆(Pisumsativum)、蠶豆(Viciafaba)、苜蓿(MedicagoSativa)、山黧豆屬(Lathyrus)等多種豆科作物和牧草的世界性害蟲，該蟲通過剌吸式口器取食寄主植物的嫩莖、葉、幼芽和花器各部位上的汁液，造成植物養(yǎng)分的損失[1]。其中苜蓿蚜蟲對苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)均有嚴重的影響，當年以及次年的產(chǎn)量都會受到影響，一般能使當年產(chǎn)量下降25%左右。同時蚜蟲也能傳播病毒對苜蓿造成危害[2-3]。

1981年由Kossel[4]首先提出植物次生性代謝產(chǎn)物或次生物質(zhì)這一名詞。有關(guān)植物對昆蟲具有防御作用的次生物質(zhì)種類很多，如香豆素類，生物堿(Alkaloid)，單寧(Tannin)，黃酮類(Flavonoids)等。研究表明生代謝物質(zhì)對害蟲具有引誘、忌避、毒殺、及殺卵作用[5-7]。植物通過合成次生代謝物質(zhì)阻止或干擾其他生物對自身的侵害，尤其是非嗜食性植物產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)對害蟲存在明顯的趨避作用[6]。香豆素(Coumarin)和兒茶酚(Catechin)是廣泛存在于自然界的植物次生代謝產(chǎn)物。香豆素是鄰羥基桂皮的酸內(nèi)酯且具有芳香甜味。它的衍生物廣泛分布于植物界，如菊科(Asteraceae)、豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)當中。很多中草藥如白芷(Angelicadahurica)、前胡(Peucedanumpraeruptorum)、茵陳(Artemisiacapillaris)和蛇床子(Clinopodiummegalanthum)等都含有香豆素類化合物。研究表明，香豆素類化合物的生理活性具有多樣性，如抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌、抗凝血等[8]。王超等[9]報道蛇床子素對菜青蟲(Pierisrapae)、小菜蛾(Plutellaxylostella)低齡幼蟲等害蟲具有觸殺作用。王志琦，沈壽國等[10]研究表明蛇床子素對辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(FusaHumgraminearumSehw.)等病原菌具有顯著的抑制作用。兒茶酚是一類帶有鄰羥基的酚類衍生物，在自然界中無處不在。兒茶酚及其衍生物可作為活性生物質(zhì)存在于多種環(huán)境中，呈現(xiàn)出顯著的化學多樣性。兒茶酚存在于多種水果蔬菜中，是酶促褐變反應的重要底物之一，具有抗氧化，抗病毒等生物特性[11]。酚類是主要次生物質(zhì)之一，同時酚類具有毒性可抑制昆蟲的取食和病原物的侵染[12]，因此酚類化合物在植物抗蟲過程中有很重要的作用。Leszczynski等[13]研究了兒茶酚等8種酚類化合物對禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi)的影響，結(jié)果表明在低濃度時，兒茶酚和鄰苯二酚對蚜蟲取食影響較大；高濃度時所有酚化合物均能降低蚜蟲的取食。有研究表明苜蓿受到牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)為害后苜蓿葉片內(nèi)的酚類、香豆素類代謝物質(zhì)含量有明顯的變化[14]，但是兒茶酚、香豆素對豌豆蚜的影響還需要進一步研究。

本研究在豌豆蚜全純?nèi)斯わ暳涎芯康幕A(chǔ)上，通過將不同濃度的香豆素和兒茶酚分別加入到豌豆蚜全純?nèi)斯わ暳现械谋∧わ曫B(yǎng)技術(shù)，測定豌豆蚜的存活率，平均產(chǎn)蚜量，產(chǎn)蚜率，相對日均體重增長率，并結(jié)合方差分析苜蓿中香豆素對紅、綠色型豌豆蚜生長發(fā)育和繁殖的影響。進一步明確人工飼喂兒茶酚和香豆素對豌豆蚜生理的影響，從而為明確苜蓿次生代謝物質(zhì)對豌豆蚜的抗性機制、抗蚜鑒定和培育新的抗性苜蓿品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

采集于甘肅農(nóng)業(yè)大學試驗田的紅、綠兩種色型的豌豆蚜。接到室內(nèi)盆栽蠶豆上放置于人工光照培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)一段時間，待產(chǎn)蚜后選用初產(chǎn)2日齡若蚜供試。

1.2 試驗方法

1.2.1豌豆蚜人工飼料的配置 本研究的人工飼料是由氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、蔗糖和磷酸鹽等按比例混合而成，所用試劑均為國產(chǎn)試劑。豌豆蚜飼養(yǎng)配方參照了葉超[15]的人工全純飼料配方，同時也參考了Prosser和Douglas于1992年發(fā)表的飼料配方，兩個配方在氨基酸的使用上有稍微的差異，前者在后者的基礎(chǔ)上將賴氨酸等幾種氨基酸分別替換為穩(wěn)定性較高的對應氨基酸的鹽酸鹽或者鹽酸鹽水物、酸等。

1.2.2兒茶酚濃度的設(shè)定 在人工飼料中添加兒茶酚，設(shè)5個兒茶酚濃度C1=0.1 mg·mL-1，C2=0.5 mg· mL-1，C3=1.0 mg·mL-1，C4=1.5 mg·mL-1，C5=2.0 mg·mL-1和一個對照組CK，共計6個處理，飼料配置完成分裝入2 ml離心管，于-20℃冰箱內(nèi)保存，存放時間不超過3個月。

1.2.3香豆素的濃度設(shè)定 在人工飼料中添加香豆素，設(shè)5個濃度梯度C1=20 mg·L-1，C2=40 mg·L-1，C3= 60 mg·L-1，C4=80 mg·L-1，C5=100 mg·L-1和一個對照組CK共6個處理，飼料配置完成分裝入2 ml離心管，于-20℃冰箱內(nèi)保存，存放時間不超過3個月。

1.2.4豌豆蚜處理 本研究所用的飼養(yǎng)籠由有機玻璃管加工而成的雙通管和石蠟膜組成。石蠟膜在使用前需要用紫外燈徹底滅菌消毒，拉伸石蠟膜封住養(yǎng)蟲籠一端，用移液器添加不同的飼料至膜上，每籠100 μL，然后在其上再覆一層石蠟膜，避免飼料溢出蟲籠。用小毛筆挑取初孵2日齡若蚜轉(zhuǎn)接至飼養(yǎng)籠內(nèi)的石蠟膜上，倒置一段時間以保證蚜蟲固定取食，再將飼養(yǎng)籠放正。每處理3個重復，每重復單體飼養(yǎng)10頭，共計30頭，綠、紅色型豌豆蚜分別置于溫度為24±1℃，22±1℃，在光周期為L∶D=12 h∶12 h，相對濕度為RH=70±5%的人工氣候箱(RXZ型)內(nèi)飼養(yǎng)。

每個養(yǎng)蟲籠里接入一頭2日齡若蟲，每接入一頭若蚜用精密電子天平稱蟲體初重W1，接蟲后第2 d起開始統(tǒng)計若蚜觀察各處理豌豆蚜的生長發(fā)育情況。若接入24 h以內(nèi)死亡的則需重新接蟲替換。每12 h觀察一次，待發(fā)育成無翅成蚜后再次稱重W2，記錄蚜蟲的存活率(Survival rate)、平均產(chǎn)蚜量(Average progeny produced)、成蚜產(chǎn)仔率(Production rate)和發(fā)育歷期DD等，計算相對日均體重增長率(RRGR)[15-17]、存活率、平均產(chǎn)仔量和平均產(chǎn)仔率。相對日均體重增長率RRGR=(lnW2-lnW1)/DD

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)資料進行數(shù)理統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度香豆素對豌豆蚜生長發(fā)育的影響

由表1可知，處理組與對照組的豌豆蚜存活率從開始統(tǒng)計到第20 d結(jié)束這個時間段內(nèi)呈下降趨勢。在第6 d時C1，C2，C3，C4和CK之間存在顯著的差異，C5和CK之間存在極顯著的差異并且C5和C1，C2，C3，C4之間也存在顯著的差異(P<0.05)。這首先表明香豆素的存在會影響紅色型豌豆蚜的存活，其次香豆素的濃度也會影響紅色型豌豆蚜的存活，香豆素的濃度越大豌豆蚜存活率越低。對于平均產(chǎn)仔量和產(chǎn)仔率而言在40 mg·L-1濃度下依然有產(chǎn)仔且與CK之間存在顯著差異(P<0.05)，但是在60 mg·L-1濃度下的平均產(chǎn)仔量和產(chǎn)仔率都變?yōu)榱?。這說明當香豆素的濃度處于40～60 mg·L-1之間時會嚴重影響到豌豆蚜的繁殖。同樣對于相對日均體重增長率而言，香豆素濃度越大增長率越小。

表1 不同濃度香豆素對紅色型豌豆蚜生長發(fā)育的影響Table 1 Effects of different density coumarin on red pea aphid

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note：Different lowercase letter indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同濃度香豆素對綠色型豌豆蚜生長發(fā)育的影響

由表2可知在香豆素濃度為20～100 mg·L-1范圍內(nèi)隨著濃度的升高綠色型豌豆蚜的存活率，產(chǎn)仔率、相對日均體重增長率都在不斷下降。當香豆素濃度達到C5時6 d和20 d的存活率與CK之間存在極顯著的差異，且20 d的存活率為0%。對產(chǎn)仔率而言處理組C1，C2，C3，C4，C5和CK之間都存在顯著的差異，并且C4，C5與CK間存在極顯著的差異，C5處理的產(chǎn)仔率是最低的為3.3%±0.3%。各處理組的相對日均體重增長率也與CK之間存在顯著的差異性。這些都表明香豆素抑制了綠色型豌豆蚜的生長繁殖。相比較而言綠色型豌豆蚜的平均產(chǎn)仔量、產(chǎn)仔率比紅色型的在同樣條件下要更大一些。

表2 不同濃度香豆素對綠色型豌豆蚜生長發(fā)育的影響Table 2 Effects of different density coumarin on green pea aphid

2.3 不同濃度的兒茶酚對紅色型豌豆蚜的生長發(fā)育和繁殖的影響

由3表可知不同濃度的兒茶酚對紅色型豌豆蚜存活率、單雌平均產(chǎn)仔量、產(chǎn)仔率及相對日均體重增長率均顯著的影響。隨著兒茶酚濃度的增加處理組和對照組的存活率在6 d和20 d時均存在顯著的差異(P<0.05)。12 d和20 d時處理組的豌豆蚜存活率以CK的最大為60.0%±0.7%，10.0%±0.5%，C5濃度下的最小為26.7%±2.0%，3.3%±0.1%。并且處理組的存活率均與CK間的差異顯著(P<0.05)。對照組和處理組的平均產(chǎn)仔量和產(chǎn)仔率以CK的最大，為5.7±0.9頭和32.4%±1.3%。其中C5濃度下的最小，為1.80±0.8頭和13.3%±0.7%。C2，C3，C4，C5與CK之間差異顯著(P<0.05)。而處理組和對照組的相對日均體重增長率則差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同兒茶酚濃度對紅色型豌豆蚜生長發(fā)育的影響Table 3 Effects of different density catechins on red pea aphid

2.4 不同濃度的兒茶酚對綠色型豌豆蚜生長發(fā)育和繁殖的影響

由表4可知在兒茶酚濃度為0.1～2.0 mg·mL-1這個范圍內(nèi)兒茶酚對綠色型豌豆蚜存活率、單雌平均產(chǎn)仔量、產(chǎn)仔率及相對日均體重增長率均有影響。綠色型豌豆蚜的存活率以CK的最高，分別為6天的100.0%±0.0%，12天的76.7%± 1.8%，20天的43.3%±0.7%；C5濃度的最低，分別為6天的73.3%±1.5%，12天的20.0%±0.0%，20天的0.0%。各處理的平均產(chǎn)仔量、產(chǎn)仔率和相對日均體重增長率均以CK的最大，分別為10.5±0.3頭，40.0%±0.7%和0.29%±0.06%，C5濃度下的最小，分別為2.0±0.0頭，3.3%±0.0%和0.20%±0.03%。而且CK和處理組之間差異顯著(P<0.05)。

表4 不同兒茶酚濃度對綠色型豌豆蚜生長發(fā)育的影響Table 4 Effects of different density catechins on green pea aphid

3 結(jié)論與討論

本研究針對香豆素和兒茶酚類化合物進行了試驗，通過試驗我們發(fā)現(xiàn)香豆素、兒茶酚對紅、綠色型豌豆蚜的生長發(fā)育及繁殖均有明顯的抑制作用。通過表1和表2我們發(fā)現(xiàn)同樣的香豆素濃度處理下的綠色型豌豆蚜的存活時間要比紅色型長很多，同樣對比表3和表4在同樣兒茶酚濃度處理下的豌豆蚜綠色型比紅色型存活時間更長。由表1可知紅色型豌豆蚜的繁殖率、產(chǎn)仔率在香豆素濃度為40～60 mg·L-1之間出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點。因為在40 mg·L-1已紅色型豌豆蚜依然有繁殖，而在60 mg·L-1下已經(jīng)完全變?yōu)?，但是表2中的綠色型則沒有出現(xiàn)這種情況。同樣對比表3和表4兒茶酚處理下綠色型豌豆蚜的產(chǎn)仔率也出現(xiàn)急劇的的下降。由以上可以說明在人工飼喂的條件下這兩種次生代謝物質(zhì)對首先影響他們的存活率其次影響它們的繁殖，并且綠色型對這兩種次生代謝物質(zhì)的承受能力更高。由于香豆素處理的紅色型豌豆蚜和兒茶酚處理的綠色型豌豆蚜的在一定濃度范圍內(nèi)繁殖率的急劇下跌我們可以設(shè)想是否在苜蓿上也存在這兩種物質(zhì)對蚜蟲的抗性閾值，當苜蓿體內(nèi)產(chǎn)生的香豆素、兒茶酚達到這個閾值時蚜蟲則不再取食轉(zhuǎn)而去尋找其他的宿主來源。

邵婭[16]等研究了單寧對豌豆蚜的生長發(fā)育的影響，表明單寧嚴重抑制豌豆蚜的生長發(fā)育。并且同樣也是對綠色型抑制作用大于紅色型，這具體是由于實驗室條件問題造成的誤差，還是因為豌豆蚜本身色型差異對兒茶酚和香豆素的敏感度差異造成的結(jié)果還需要進一步的研究。盧繼榮[17]報道了馬桑中除了主要的馬桑毒素具有殺蟲活性外，還有香豆素類化合物具有殺蟲活性。陶茸等研究表明香豆素對苜蓿根系伸長生長、根緣細胞活性有明顯的低濃度促進高濃度抑制效應[18]。通過對兒茶酚和香豆素的實驗我們的結(jié)果和陳巨蓮[19]等結(jié)果相似。有研究表明，單寧、總酚與苜蓿的防御能力成正相關(guān)關(guān)系[20]，但是在蚜蟲危害苜蓿時香豆素與苜蓿的防御能力沒有明確的相關(guān)關(guān)系。武德功[21]等利用了生命表技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，紅、綠兩種色型豌豆蚜對不同的抗蚜品種致害性不同導致了紅、綠色型豌豆蚜之間的差異，我們在同樣的條件下對紅色型豌豆蚜進行了試驗，次生代謝物質(zhì)香豆素、兒茶酚對紅色型豌豆蚜的生長繁殖抑制顯著，對綠色型的抑制沒有紅色型的明顯。

綜上所述，在相同的人工飼喂條件下綠色型豌豆蚜對兒茶酚、香豆素的耐受性更高，但是在苜宿體內(nèi)這兩種次生代謝物質(zhì)是不是和它們的抗性成正相關(guān)關(guān)系，以及在苜宿體內(nèi)具體的作用機制均尚未明確。因此本研究從豌豆蚜的角度對苜蓿的次生代謝物質(zhì)兒茶酚和香豆素進行了研究，為進一步的研究苜蓿、次生代謝物質(zhì)、豌豆蚜三者之間的抗性互作機理提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。